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Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 1211 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Ein wesentliches Merkmal, das den 3D-Biodruck von anderen 3D-Zellkulturtechniken unterscheidet, ist die präzise Kontrolle der erzeugten Strukturen. Diese Eigenschaft ermöglicht die hochauflösende Herstellung biomimetischer Strukturen mit kontrollierten strukturellen und mechanischen Eigenschaften wie Porosität, Permeabilität und Steifigkeit. Die Analyse der Zelldynamik nach dem Drucken und die Optimierung ihrer Funktionen innerhalb der 3D-gefertigten Umgebung ist jedoch nur durch Versuch und Irrtum und die Wiederholung mehrerer Experimente möglich. Dieses Problem motivierte die Entwicklung eines zellulären Automatenmodells zum ersten Mal, um das Zellverhalten nach dem Drucken innerhalb des 3D-Bioprint-Konstrukts zu simulieren. Um unser Modell zu verbessern, haben wir ein 3D-Konstrukt mit zellbeladenem MDA-MB-231-Hydrogel biogedruckt und die Zellfunktionen, einschließlich Lebensfähigkeit und Proliferation, in 11 Tagen bewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass unser Modell die 3D-Biodruckstruktur erfolgreich simulierte und In-vitro-Beobachtungen erfasste. Wir haben gezeigt, dass das In-silico-Modell biologische Funktionen nach dem Drucken für unterschiedliche anfängliche Zellzahlen in Bioink und verschiedene Bioink-Formulierungen mit Gelatine und Alginat vorhersagen und aufklären kann, ohne mehrere kostspielige und zeitaufwändige In-vitro-Messungen zu wiederholen. Wir glauben, dass ein solcher Rechenrahmen die zukünftige Anwendung des 3D-Biodrucks erheblich beeinflussen wird. Wir hoffen, dass diese Studie Forscher dazu inspiriert, weiter zu erkennen, wie ein In-silico-Modell verwendet werden könnte, um die In-vitro-3D-Bioprinting-Forschung voranzutreiben.

Eine der aufstrebenden 3D-Biofabrikationsmethoden ist das dreidimensionale (3D) Bioprinting, das in der regenerativen Medizin und im Tissue Engineering weit verbreitet ist, um komplexe gewebemimetische Strukturen herzustellen1. Die Anwendung dieser Technik hat ein großes Potenzial für die personalisierte Therapie, wobei der Schwerpunkt stärker auf der Kontrolle der Arzneimittelfreisetzung, dem Arzneimittelscreening zur Krebsbehandlung, der Untersuchung möglicher Nebenwirkungen und der Analyse der Metastasierung und Invasion von Tumorzellen liegt2. Die 3D-Biodrucktechnik kombiniert Zellen, Biomaterialien und kontrollierte motorische Systeme, um komplexe 3D-Strukturen zu entwickeln und ermöglicht eine genaue Kontrolle über die Strukturmerkmale wie mechanische Eigenschaften, Porosität, Durchlässigkeit und Steifigkeit3,4,5. Diese Technik kann mehrere Einschränkungen der herkömmlichen 3D-Methoden überwinden, indem sie wichtige Aspekte des zellulären Lebensraums einbezieht. Zu diesen Aspekten gehören eine ungleichmäßige 3D-Mikroumgebung ähnlich der natürlichen extrazellulären Matrix (ECM) von Tumoren, komplexe Interaktionen von Zellen mit ihren Nachbarzellen und mit der lokalen ECM sowie komplizierte Diffusionsprozesse von Nährstoffen und Sauerstoff6,7,8. Somit kann diese Methode verwendet werden, um Einblicke in Zellwachstumsmechanismen besser darzustellen und eine genauere Vorhersage der In-vivo-Tumordynamik und der Reaktion von Krebszellen auf Therapien zu ermöglichen7.

Trotz der schnellen Weiterentwicklung der 3D-Bioprinting-Methode gibt es einige Herausforderungen, die angegangen werden müssen. Derzeit basiert die Bioprinting-Technik hauptsächlich auf einer Versuch-und-Irrtum-Methode, um die gewünschte Leistung zu erzielen, was den Bedarf an experimentellen Techniken erhöht. Diese Versuch-und-Irrtum-Basis umfasst die Optimierung der Bioink-Eigenschaften und ihrer Druckbarkeit, der mechanischen Festigkeit der Struktur und der Lebensfähigkeit der Zellen während und nach dem Drucken. Daher ist es sehr kostspielig, Bioprinting-bezogene Experimente zu optimieren9. Diese Herausforderungen machen den Versuchsaufbau und die Datenerfassung in diesem Prozess komplizierter.

In-silico-Methoden können verwendet werden, um In-vitro-Experimente zu ergänzen und dabei zu helfen, einige der Einschränkungen dieser 3D-Methode zu beseitigen10,11,12. Zu den gängigen In-Silco-Ansätzen gehören Methoden des maschinellen Lernens (ML) und mechanistische Modellierung. ML-Modelle können weiter in tiefe neuronale Netze, Zufallswälder, Support-Vektor-Maschinen (SVM) und Baumklassifikatoren kategorisiert werden. Es wird immer bekannter, dass ML in verschiedenen Phasen des 3D-Druckprozesses eingesetzt wird, beispielsweise bei der Prozessoptimierung, der Analyse der Konstruktionsgenauigkeit, der Fehlerdiagnose und der Vorhersage von Bioink-Eigenschaften13. Beispielsweise haben Xu et al.14 mithilfe von ML-Ansätzen erfolgreich ein Vorhersagemodell erstellt, um die Lebensfähigkeit der Zellen mit guter Empfindlichkeit vorherzusagen und die Bedeutung verschiedener Prozessparameter, einschließlich UV-Intensität und UV-Belichtungszeit, für die Lebensfähigkeit der Zellen beim Stereolithographie-basierten 3D-Biodruck zu bewerten . In mehreren Studien wurde auch versucht, verschiedene ML-basierte Techniken zu entwickeln, um die Druckbarkeit von Bioinks zu optimieren. Beispielsweise demonstrierten Lee J et al.15 mithilfe einer multiplen Regressionsanalyse den Zusammenhang zwischen der Bedruckbarkeit und den mechanischen Eigenschaften der Tinte. Trotz der großen Fortschritte bei der Anwendung von ML-Modellen in den biomedizinischen Wissenschaften weist diese Methode jedoch je nach Datenerfassungsprozess und Ziel der Studie einige Einschränkungen auf.

Um genaue Vorhersagen zu treffen, erfordern ML-Modelle große Datenmengen, die Auswahl eines geeigneten Algorithmus und die Bestimmung der interessierenden Ein- und Ausgaben16. Es kann unpraktisch sein, große Datenmengen aus der Bioprinting-Forschung zu erfassen, die teure Zellen und Materialien sowie zeitaufwändige Prozesse erfordert. Eine weitere häufige Herausforderung bei ML-Anwendungen besteht darin, dass sie möglicherweise schwer zu interpretieren sind. Dies kann zu mangelndem Vertrauen seitens der Forscher führen, die nach einer mechanistischen Interpretation des Zellverhaltens in biogedruckten Strukturen suchen17. Im Gegensatz dazu geht es bei der mechanistischen Modellierung um die Beschreibung von Phänomenen anhand von Hypothesen für zugrunde liegende Mechanismen. Zu den mechanistischen Modellen gehören stochastische und agentenbasierte Modelle, diskrete Modelle, gewöhnliche Differentialgleichungen (ODEs) und partielle Differentialgleichungen (PDEs). Solche mechanistischen Modelle können Einblick in die mechanistischen Aspekte des Zellverhaltens in biogedruckten Strukturen geben. und sind daher unsere bevorzugte mathematische Technik in dieser Studie.

Im Rahmen des 3D-Bioprinting-Prozesses wird zunehmend an mechanistischer Modellierung und Simulation geforscht. Beispielsweise gibt es mehrere mathematische Studien, die die auf die Biotinte und die Zellen in der Düse ausgeübte Scherspannung vorhersagen18,19; Vorhersage der mechanischen Eigenschaften der endgültigen gedruckten Struktur basierend auf den Eigenschaften des Bioink-Materials20; und Simulation der Bioink-Ablagerung und der endgültigen Form der erstellten 3D-Struktur9. Mit diesen mathematischen Techniken wurde versucht, den Bioprinting-Prozess – während und nach dem Bioprinting – zu simulieren, um die Wirkung verschiedener Parameter auf verschiedene Aspekte des Bioprintings zu untersuchen, einschließlich der Lebensfähigkeit der Zellen und der strukturellen Stabilität.

Eine umfassende rechnerische Untersuchung des Post-Printing-Verhaltens von Zellen, die in 3D-Bioprint-Strukturen eingebettet sind, steht jedoch noch aus. Solche mathematischen Studien können Forschern mehr Einblick in die Zellfunktion nach dem Drucken geben und es ihnen ermöglichen, komplexe zelluläre Aktivitäten vorherzusagen und die zelluläre Mikroumgebung zu optimieren, um Geld und Zeit zu sparen, indem experimentelle Auswertungen auf ein Minimum beschränkt werden. Dies ist die erste Studie, die darauf abzielt, eine Integration von In-vitro- und In-silico-3D-Bioprint-Brustkrebsmodellen zu entwickeln, um das Post-Printing-Verhalten einer Population von Brustkrebszellen zu untersuchen, die in eine 3D-Bioprint-Struktur eingebettet sind (Abb. 1). In der In-vitro-Studie verwendeten wir die Zelllinie MDA-MB-231, eine der aggressivsten Brustkrebszelllinien, die am häufigsten in krebsbezogenen Studien verwendet wird. Zur Entwicklung des Bioinks wird eine Mischung aus Gelatine und Alginat als das am häufigsten verwendete Bioink-Material im 3D-Bioprinting ausgewählt, da es ähnliche Eigenschaften wie natives ECM aufweist und für Bioprinting-Anwendungen geeignete physiologische und biologische Eigenschaften aufweist21. Für unsere In-silico-Studie haben wir die Modellierung zellulärer Automaten ausgewählt, bei der die meisten Parameter aus experimentellen Daten ausgewählt wurden. Außerdem wurden umfassende In-vitro-Tests durchgeführt, um die Zuverlässigkeit des Modells zu verbessern.

Schematische Darstellung der Hauptschritte dieser Studie; Schritt 1: Vorbereitung von Bioink bestehend aus Gelatine, Alginat und der Zelllinie MDA-MB-231; Schritt 2: Drucken und Vernetzen der zellbeladenen 3D-Struktur; Schritt 3: Durchführung von In-vitro-Assays nach dem Drucken; Schritt 4: Entwicklung und Kalibrierung eines In-silico-Modells. Erstellt mit BioRender.com.

Das in dieser Studie vorgeschlagene agentenbasierte Modell eignet sich für die Demonstration komplexer zellulärer Systeme, einschließlich Zellproliferation, Bewegung, Zellinteraktionen mit der Umgebung (z. B. ECM, benachbarte Zellen und Ressourcenverbrauch) und Zellaggregation innerhalb des Gerüsts. In dieser Studie zeigen wir, dass mathematische Modelle und In-silico-Simulationen zur Erfassung der In-vitro-Dynamik verwendet werden können. Eine solche Kombination aus In-vitro- und In-silico-Studien kann das Verständnis der Forscher über Zellaktivitäten in 3D-Bioprint-Konstrukten verbessern, um die Genauigkeit von Optimierungen und experimentellen Einstellungen zu beschleunigen und zu erhöhen. Das vorgeschlagene In-silico-Modell ist sehr vielversprechend und kann weiterentwickelt werden, um in der 3D-Zellkultivierung mithilfe von Bioprinting-Techniken in verschiedenen biomedizinischen Anwendungen eingesetzt zu werden.

Das tumorähnliche Hydrogel-Netzwerkmodell wurde erfolgreich gedruckt (Abb. 2a). Um die Proliferation der im Hydrogel eingebetteten MDA-MB-231-Zellen zu bestimmen, wurde der MTT-Assay verwendet, um die zelluläre Stoffwechselaktivität an den Tagen 0, 4, 7, 10 und 11 zu überwachen. Wie in Abb. 2b dargestellt, im Vergleich zu Tag 0, MDA-MB-231-Zellen im 3D-Zell/Hydrogel-Konstrukt zeigten an den Tagen 4, 7, 10 und 11 eine 1,86-, 2,7- und 2,78- bzw. 2,8-fache Proliferation. Tatsächlich zeigten die Zellen in den ersten 7 Tagen eine schnelle Proliferation und hielten vom 7. bis zum 11. Tag nahezu ein Plateau der Zellproliferation aufrecht. Interessanterweise zeigten die Ergebnisse, dass die Verdopplungszeit des in der 3D-Mikroumgebung eingekapselten MDA-MB-231 dreimal höher war als die von in 2D-Kulturen gezüchteten Zellen, was auf die verringerten Zellaktivitäten innerhalb der 3D-Matrix22 zurückzuführen ist. Von Tag 7 bis Tag 11 blieb die Anzahl der proliferierenden Zellen annähernd konstant und ließ die Frage offen, ob die Zellen aufgrund unerwünschter Bedingungen abgestorben sind oder in die nichtproliferierende Phase (Ruhe) übergegangen sind. Um diese Frage zu beantworten, wurden über einen Zeitraum von 11 Tagen weiterhin ein Lebend-Tot-Assay sowie eine Ki-67-Immunfärbung eingesetzt, um ein besseres Verständnis des im 3D-Gerüst eingebetteten Zellverhaltenswachstums zu erhalten.

(A): Hergestellte Zell-/Hydrogelstruktur mithilfe der 3D-Bioprinting-Technik; (B): MDA-MB-231-Proliferation eingebettet im Hydrogel-Netzwerk nach dem Drucken von Tag 0 bis Tag 11. Fehlerbalken stellen ± SD, n ≥ 3 dar.

Die Lebensfähigkeit von MDA-MB-231 über 11 Tage wurde mittels Lebend-Tot-Färbung sichtbar gemacht, was mit den Ergebnissen des MTT-Assays übereinstimmte. Wie in Abb. 2 gezeigt, waren die meisten Zellen nach dem Drucken lebensfähig, und die Lebensfähigkeitsrate der Zellen betrug am Tag 0 76 ± 2 %, was deutlich zeigt, dass der Bioprinting-Prozess die Lebensfähigkeit der Zellen nur geringfügig beeinträchtigt hat. Die Lebensfähigkeit stieg in der ersten Woche an und erreichte am 4. und 7. Tag 98 ± 1 % bzw. 99 ± 1 %. Daher war die Struktur porös genug, damit Sauerstoff und Glukose durch das Hydrogelgerüst diffundieren und sich verteilen konnten, was den Zellen eine geeignete Lebensumgebung bieten könnte. Vom 7. bis zum 11. Tag starben zwar einige Zellen, die Mehrheit der Zellen überlebte jedoch und die Lebensfähigkeitsrate erreichte am 11. Tag 96 ± 2 %. Durch Vergleich der Ergebnisse des Lebend-Tot-Assays und des MTT-Assays kann man schlussfolgern, dass Ein erheblicher Teil der Zellen trat sieben Tage nach Erreichen der maximalen Kapazität des Gerüsts in die Ruhephase ein, und einige der Zellen begannen während der langfristigen stationären Phase oder aufgrund fehlender Ressourcen abzusterben. Der Zelltod ist in diesem Experiment nahezu vernachlässigbar, was das vielversprechende Potenzial des Gelatine/Alginat-Gerüsts für Bioprinting-Anwendungen für lange Zeit verdeutlicht.

Um die Proliferationskapazität von MDA-MB-231 sichtbar zu machen, wurden Zellen fixiert und ein Anti-Ki-67-Antikörper verwendet, um proliferierende Zellen unter einem konfokalen Mikroskop abzubilden (Abb. 3, 4). Ki-67 ist ein häufig verwendeter Marker, der in allen aktiven Phasen des Zellzyklus vorhanden ist, in der stationären Phase jedoch in Zellen fehlt23. Die Ergebnisse zeigten, dass an den Tagen 0 und 4 fast 98 ± 1 % bzw. 95 ± 2 % der Zellen positiv für Ki-67 waren, während diese Zahl am Tag 7 auf 86 ± 2 % sank, gefolgt von einem dramatischen Rückgang auf etwa 48,2 ± 2,4 am 11. Tag. Dieses Ergebnis stimmt mit den vorherigen Daten überein (Abb. 3) und zeigt, dass die Zellen innerhalb von sieben Tagen nicht nur überleben, sondern auch ihre Proliferationsfähigkeit beibehalten. Von Tag 7 bis Tag 11 erwies sich ein großer Teil der Zellen zwar als lebendig, sie befanden sich jedoch im Ruhezustand und konnten sich nicht mehr vermehren, da nicht genügend Platz für die Vermehrung der Zellen vorhanden war. Darüber hinaus aggregierten die Zellen an den Tagen 7 und 11 stärker, insbesondere in der Nähe der Poren, und es zeigte sich, dass sich die Zellen im Zentrum der Zellaggregate nicht vermehrten, da sie von anderen Zellen umgeben waren. Daher wurde der Proliferationsprozess abgebrochen, da nicht genügend Platz für die Platzierung von Tochterzellen vorhanden war und im Zentrum der Aggregate Nährstoffe und Sauerstoff fehlten.

Mikroskopische Bilder, die die Lebensfähigkeit von MDA-MB-231-Zellen in 3D-Hydrogelkonstrukten unter Verwendung des fluoreszierenden Live/Dead-Assay-Kits von Tag 0 bis Tag 11 zeigen. Lebende und tote Zellen wurden mit Calcein-AM bzw. PI gefärbt (grüne Farbe steht für lebende Zellen). ; rote Farbe steht für tote Zellen). Die Zellen wurden mit dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop abgebildet. Maßstabsbalken, 50 μm (vergrößerte Bilder, Maßstabsbalken, 30 μm).

Ki-67-Färbung von verkapselten MDA-MB-231-Zellen in 3D-Bioprint-Konstrukten. Die Zellen wurden mit Anti-Ki-67-Antikörpern gefärbt, die mit Alexa Fluor 546 und Hoechst 33.342 sichtbar gemacht wurden (rote Farbe steht für Ki-67-positive Zellen; blaue Farbe steht für alle Zellen). Die Zellen wurden mit dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop abgebildet. Maßstabsbalken, 50 μm (vergrößertes Bild, Maßstabsbalken, 30 μm).

Die Ergebnisse der In-vitro-Experimente wurden zur Parametrisierung des entwickelten mathematischen Modells verwendet.

Eine wesentliche Eigenschaft, die die 3D-Bioprinting-Technik den anderen 3D-Zellkulturtechniken überlegen macht, ist die präzise Kontrolle über erzeugte Strukturen. Diese Eigenschaft bietet die Möglichkeit, biomimetische Strukturen mit kontrollierten strukturellen und mechanischen Eigenschaften wie Porosität, Permeabilität und Steifigkeit mit hoher Auflösung herzustellen24,25,26. Die Analyse des Zellverhaltens innerhalb des Gerüsts nach dem Drucken hängt jedoch nur von der Durchführung verschiedener In-vitro-Messungen ab. Die experimentelle Messung einiger Aspekte des Zellverhaltens in 3D-Biodruckstrukturen ist eine Herausforderung, da präzise quantitative Techniken fehlen, beispielsweise die Definition von Zell-Zell- und Zell-Mikroumgebungs-Wechselwirkungen. Dieses Problem hat uns dazu motiviert, ein mathematisches Rahmenwerk zu entwickeln, um das Zellverhalten innerhalb des Gerüsts nach dem Drucken zu simulieren. Dieses Framework muss nicht nur diese Herausforderungen meistern, sondern auch zelluläre Funktionen nach dem Drucken genau entwerfen und vorhersagen, ohne Experimente wiederholen zu müssen.

Die individuenbasierte Modellierung mithilfe eines zellulären Automaten ist eine Methode zur Simulation des räumlichen und zeitlichen Mechanismus des Zellwachstums auf zellulärer Ebene27,28. Bei diesem Ansatz handelt es sich um ein dynamisches System, das Zellengitter umfasst und jede Zelle über Sätze diskreter Zustände verfügt29. CA-Modellierung wurde in den letzten Jahren häufig eingesetzt, um verschiedene Mechanismen von Krebszellen auf der Grundlage verschiedener statischer Automatenregeln zu untersuchen30. Bisher wurde jedoch in keiner Studie die CA-Modellierung bei der 3D-Kultivierung von Krebszellen mittels 3D-Bioprinting angewendet. Wir haben diese mathematische Methode für diese Studie zur Simulation des Zellwachstums in einer 3D-Biodruckstruktur ausgewählt, da sie räumliche Eigenschaften der 3D-Druckstruktur erfassen kann und flexibel ist, um verschiedene Hypothesen zu untersuchen. Da die aus unseren In-vitro-Experimenten gewonnenen Daten außerdem Zellen in diskreter Form enthielten, wäre mit dieser diskreten mathematischen Technik eine genauere Simulation dieses Prozesses möglich. Der in dieser Studie entwickelte Rahmen stellt Regeln für Zellproliferation, Lebensfähigkeit, Bewegung und Interaktionen mit der Umgebung dar, einschließlich Hydrogel und benachbarten Zellen, sowie Clusterbildungen innerhalb des Hydrogelnetzwerks. Die in diesem Artikel dargestellten In-silico-Ergebnisse basieren auf Mittelwerten und Standardabweichungen von n = 100 Simulationsläufen, wobei n durch Konsistenzanalyse (Ergänzungsmaterial, Konsistenzanalyse) motiviert ist.

Abbildung 5, die die Zellproliferationsmuster für 11 Tage innerhalb des Gerüsts sowohl für In-vitro als auch für In-silico zeigt, veranschaulicht sie in Übereinstimmung miteinander. Bei der Zellproliferation sind die anfängliche Zelldichte und die Gerüstkapazität zwei Schlüsselparameter, die wir als \({C}_{\mathrm{initial}}\) bzw. \(C\)-Variablen angegeben haben. Die entsprechenden Werte dieser Parameter wurden mittels Kalibrierung ermittelt, um eine optimale Anpassung an die In-vitro-Studien zu erzielen. Beachten Sie, dass die anfängliche Zelldichte im entwickelten Modell die effektive anfängliche Zellpopulation darstellt, die innerhalb einer dünnen Schicht miteinander interagieren kann, und nicht die Gesamtzahl der Zellen im Gerüst. Daher wurde die simulierte Zelldichte im Vergleich zur Zelldichte in den experimentellen Einstellungen um einen Skalierungsfaktor reduziert. Die Ergebnisse zeigten, dass die Zellen sowohl in der Simulation als auch im Experiment nach sieben Tagen die maximale Zelldichte erreichten. Die Zeit, die die Zellen brauchten, um im Gerüst die maximale Dichte zu erreichen, hing stark von der Anzahl der anfänglichen Zellen und der Kapazität des gedruckten Gerüsts ab. Je größer die Anzahl der Ausgangszellen und je geringer die Gerüstkapazität, desto eher erreichten die Zellen die maximale Zelldichte und stoppten die Proliferation. Daher können Forscher durch die Feinabstimmung dieser Parameter und die Durchführung von Simulationen in verschiedenen Szenarien die Experimente so gestalten, dass sie die gewünschten Ergebnisse erzielen, ohne In-vitro-Assays wiederholen zu müssen.

Vergleich zwischen In-vitro- und In-silico-Ergebnissen der MDA-MB-231-Zellproliferation innerhalb des 3D-Hydrogelnetzwerks. Fehlerbalken repräsentieren ± SD, n ≥ 3.

Simulierte Daten waren auch in der Lage, die experimentellen Ergebnisse zur Lebensfähigkeit und Proliferation konsistent zu reproduzieren. Wie im vorherigen Abschnitt erläutert, zeigten die Zellen zwar innerhalb von sieben Tagen nach dem Drucken eine Lebensfähigkeit von etwa 99 %, doch die Zahl der toten Zellen stieg vom 7. bis zum 11. Tag leicht an, als sich der erhebliche Teil der Zellen in der Ruhephase befand. Um den In-vitro-Zustand genau zu simulieren, wurde daher angenommen, dass Zellen, die länger als die angegebenen Stunden in einer verlängerten stationären Phase verblieben, definiert durch eine stochastische Zahl (\({C}_{d}\)), starteten mit einer bestimmten Wahrscheinlichkeit (\({P}_{d}\)) sterben. Diese Beobachtung kann biologisch durch die Unfähigkeit der Zellen erklärt werden, nach Eintritt in die stationäre Zellphase wieder in den Zellzyklus einzutreten.

Abbildung 5 zeigt die Schnappschüsse von In-silico-MDA-MB-231-Zellen, die innerhalb des Hydrogelnetzwerks wachsen; sowie in-vitro-mikroskopische Bilder von Zellen in der 3D-Struktur. In dieser Abbildung können Sie die Zellverteilung und das Fortschreiten der Zellclusterbildung an den Tagen 0, 4, 7 und 11 sowohl für in vitro als auch für in silico sehen. In den In-silico-Bildern stehen gelbe, rote und schwarze Zellen stellvertretend für proliferierende, nicht proliferierende bzw. tote Zellen.

Am Tag 0 waren einige Zellen innerhalb des Hydrogelnetzwerks verteilt. Im Laufe der Zeit vermehrten sich die Zellen und bildeten zunächst zweizellige Cluster und dann größere. Ähnlich wie bei In-vitro-Beobachtungen blieb der Prozentsatz der Lebensfähigkeit bis zum 11. Tag bei etwa 100 %, dann nahm die Lebensfähigkeit leicht ab und erreichte 93,74 ± 0,5 %. Darüber hinaus nahm die simulierte Zellproliferation im Laufe der Zeit ab und kam nach sieben Tagen aufgrund des Erreichens der maximalen Kapazität des Gerüsts zu einem deutlichen Rückgang; und sank schließlich am 11. Tag auf 54,14 ± 0,25 %. Die Animation des Zellwachstums innerhalb des Hydrogelgerüsts in 11 Tagen ist auch im Zusatzmaterial verfügbar (Abbildung S3).

Ein weiterer wichtiger Faktor neben der Lebensfähigkeit und Proliferation der Zellen ist die Fähigkeit der Zellen, sich in ihrer umgebenden Matrix zu bewegen. Diese Simulation kann auch zur Analyse der Zellbewegung sowie der Struktur und Verteilung gebildeter Tumorcluster im Hydrogelnetzwerk ohne experimentelle Bewertung eingesetzt werden. Tumorcluster können aufgrund von Interaktionen zwischen benachbarten Zellen oder zwischen Eltern- und Tochterzellen entstehen, abhängig von ihrer Position und der Mikroumgebung31. Tatsächlich koordinieren Zellen durch physikalische Zell-Zell-Interaktionen und Signalinteraktionen und bilden Cluster.

In Abbildung S1 (Ergänzungsmaterial) zeigen Zellen einen Trend zum Kriechen in Richtung Gerüstporen, gefolgt von der Bildung von Clustern um diese Poren, da dort lebenswichtige Ressourcen in größerer Konzentration vorliegen, insbesondere nach sieben Tagen. Diese Tatsache legt nahe, dass die Hydrogel-Netzwerke über eine begrenzte Kapazität zum Transport von Ressourcen verfügten. Daher haben wir bestimmte Anziehungsbereiche sowohl für die Zell-Zell-Signalisierung (\({L}_{C}\)) als auch für die Zellporen-Anziehung (\({L}_{p}\)) definiert, um verschiedene Zellen zu berücksichtigen Migrationsrichtungen. Die Bewegungsgeschwindigkeit war ein weiterer wichtiger Parameter, der die Clusterbildung beeinflusste. Fallica et al. zeigten, dass die Bewegung von Krebszellen in 3D-Mikroumgebungen gehemmt wird und aufgrund der Kombination aus Materialsteifigkeit und der Verankerung von Zellrezeptoren eine extrem niedrige Geschwindigkeit aufweist22. Daher haben wir basierend auf den Beobachtungen in dieser und früheren Studien die Zellbewegungsgeschwindigkeit kalibriert. Bei den Bewegungsvorgängen bewegte sich jedes Individuum zu einem bestimmten Zeitpunkt, der als \({m}_{C}\) definiert ist, in eine Richtung, die auf der Grundlage der Zellanziehung bestimmt wurde. Während des Kalibrierungsprozesses wurde durch den Vergleich von In-vitro- und In-silico-Ergebnissen der Schluss gezogen, dass Zellen innerhalb eines kleineren Anziehungsbereichs (\({L}_{C}\)) im Vergleich zu weniger dazu neigen, sich auf benachbarte Zellen zu bewegen die Oberfläche/Poren des Gerüsts (\({L}_{p}\)). Durch die Anwendung dieser Regeln im Modell (Abb. 6) ahmen Zellen das zelluläre In-vitro-Verhalten in Bezug auf Bewegung und Clusterbildung nach. Die Ergebnisse des vorgeschlagenen Modells stimmen mit denen früherer Studien22,32 überein.

Die mittleren Felder veranschaulichen das MDA-MB-321-Wachstum innerhalb des 3D-Hydrogel-Konstrukts in silico; Gelb steht für proliferierende Zellen; Rot steht für nicht proliferierende Zellen; Schwarz steht für tote Zellen. Die rechten und linken Felder stellen MDA-MB-231-Zellen dar, die in 3D-Hydrogelkonstrukten eingekapselt sind und mit einem Phasenkontrastmikroskop am Tag 0, Tag 4, Tag 7 und Tag 11 beobachtet wurden: Maßstabsbalken, 50 μm.

Im Allgemeinen wurde dieses Modell für die Kombination mit In-vitro-3D-Bioprinting-Bewertungen entwickelt, was zu einer umfassenden Analyse der gesamten 3D-gefertigten Strukturen führt. Eine der Hauptanwendungen dieser Simulation besteht darin, das zelluläre Verhalten nach dem Drucken in einer ungeübten Mikroumgebung vorherzusagen, wodurch die Fähigkeit verbessert wird, gewünschte biologische Einstellungen zu reproduzieren. Dieses Modell bietet beispielsweise die Möglichkeit, den Einfluss verschiedener wichtiger Parameter wie verschiedener anfänglicher Zelldichten auf das Zellverhalten über einen längeren Zeitraum zu bewerten. Dies kann für Forscher von Vorteil sein, da sie eine geeignetere Mikroumgebung für das Zellwachstum schaffen können, ohne dass Experimente wiederholt werden müssen. Beispielsweise können sie das Gerüst im Hinblick auf Größe oder Strukturform entwerfen, um die Gerüstkapazität zu modifizieren, um die Zellproliferation zu verbessern und den Zelltod zu verringern.

Um das In-silico-Modell weiter zu validieren, führten wir die Bioprinting-Verfahren mit unterschiedlichen experimentellen Variablen in zwei verschiedenen Situationen durch: Fall 1: variierende anfängliche Zelldichten; Fall 2: Variation der Bioink-Formulierung. In Fall 1 führten wir Bioprinting mit einem Bioink mit 4 % (\(w/v\)) Gelatine, 4 % (\(w/v\)) Alginat und 1,5 × 1 \({0}^{6} durch. \) MDA-MB-231-Zellen \({\mathrm{mL}}^{-1}\). In Fall 2: Wir führten Bioprinting-Experimente mit einem Bioink mit Endkonzentrationen von 4 % (\(w/v\)) Gelatine, 5 % (\(w/v\)) Alginat und 2 × 1 \({0} durch. ^{6}\) MDA-MB-231-Zellen \({\mathrm{mL}}^{-1}\). Mithilfe des kalibrierten In-silico-Modells möchten wir das Proliferationsmuster von Zellen unter diesen beiden neuen Bedingungen vorhersagen.

Abbildung 7, die die Zellproliferationsmuster für 10 Tage für Fall 1 sowohl in vitro als auch in silico zeigt, veranschaulicht sie in Übereinstimmung miteinander. Im In-silico-Modell haben alle Parameter außer \({C}_{\mathrm{initial}}\) (die anfängliche Zelldichte) die gleichen Werte wie im kalibrierten Modell. Die simulierte Zelldichte wird im Vergleich zur Zelldichte in den experimentellen Einstellungen um den gleichen Skalierungsfaktor reduziert und auf \({C}_{\mathrm{initial}}=2000\) gesetzt. Sowohl Simulationen als auch Experimente zeigten, dass die Zellen nach 7 Tagen nicht die maximale Zelldichte erreichten und weiter wuchsen. Wenn also die Anzahl der Anfangszellen abnahm, erreichten die späteren Zellen ihre Gerüstkapazität und hörten folglich auf, sich zu vermehren.

Vorhersage der Zellproliferation mithilfe des In-silico-Modells für Fall 1: 1,5 × 1 \({0}^{6}\) MDA-MB-231-Zellen \({mL}^{-1}\) in 4 % Gelatine/ 4 % Alginat-Bioink; am Tag 0, 3, 7 und 10. Die In-vitro-Studie wurde unter Verwendung des MTT-Assays durchgeführt. Fehlerbalken repräsentieren ± SD, n ≥ 3.

Abbildung 8, die die In-vitro- und In-silico-Zellproliferationsmuster für Fall 2 vergleicht, zeigt ebenfalls Übereinstimmung. In diesem Fall haben wir experimentell die Formulierung von Bioink geändert. Eine Erhöhung der Alginatkonzentration kann die Steifigkeit einer Konstruktion auf Hydrogelbasis erhöhen, wie bereits gezeigt33. Es wurde auch festgestellt, dass die Steifheit der Mikroumgebung auch die Zellbewegung und die Sphäroidbildung innerhalb des Gerüsts beeinflusst34. Obwohl Parameter, die direkt mit der Steifigkeit zusammenhängen, noch nicht in unser Modell integriert wurden, können wir das zelluläre Verhalten regulieren und die Auswirkungen der Bioink-Formulierung und -Steifigkeit auf Proliferation und Migration untersuchen, indem wir einige Regeln der Zellbewegung variieren. Im kalibrierten Modell für Bioink, das 4 % (w/v) Gelatine und 4 % (w/v) Alginat enthält, bewegen sich die Zellen alle 15 Stunden, bezeichnet durch \({m}_{c}\). Mit 4 % (Gew./Vol.) Gelatine und 5 % (Gew./Vol.) Bioink auf Alginatbasis reduzieren wir die Bewegungsgeschwindigkeit von Zellen, die in einer steiferen Mikroumgebung eingekapselt sind, und ändern \({m}_{c}\) zu 20 h unter Beibehaltung anderer Parameter. Beim Vergleich der Ergebnisse eines In-silico-Modells mit In-vitro-Daten kommen wir zu dem Schluss, dass für 4 % (Gew./Vol.) Gelatine und 5 % (Gew./Vol.) Bioink auf Alginatbasis \({m}_{c}\ )=20 Stunden entsprechen weitgehend dem In-vitro-Proliferationstrend innerhalb von 11 Tagen.

Vorhersage der Zellproliferation mithilfe des In-silico-Modells für Fall 2: 2 × 1 \({0}^{6}\) Zellen \({mL}^{-1}\) in 4 % Gelatine/5 % Alginat-Biotinte. Die In-vitro-Studie wurde mit dem MTT-Assay durchgeführt. Fehlerbalken repräsentieren ± SD, n ≥ 3.

Die In-vitro-Beobachtungen ergaben, dass die Zellproliferation am 11. Tag leicht abnahm, was durch die steifere Mikroumgebung erklärt werden kann. Tatsächlich könnte die Starrheit die Zellbewegung und -proliferation verringern; und behindern den Transport von Nährstoffen, was mit der Zeit zum Zelltod führt. Für größere Änderungen in der Bioink-Formulierung ist es notwendig, die Steifigkeit der Mikroumgebung oder bioinkbezogene Parameter in das Modell einzubeziehen, um das Zellverhalten genau vorherzusagen. Mit 4 % (\(w/v\)) Gelatine, 5 % (\(w/v\)) Alginat und geringfügigen Änderungen an der Bioink-Formulierung kann unser entwickeltes Modell jedoch erfolgreich eingesetzt werden.

Insgesamt konnten wir unser Modell validieren, indem wir Variationen in den In-vitro-Daten erstellten und die unterschiedliche Situation erfolgreich simulierten. Daher können wir mit Zuversicht behaupten, dass dieses Modell Forschern dabei helfen kann, Experimente genauer zu planen, indem es das Ergebnis vorhersagt. Tatsächlich können Forscher, die Simulationen unter verschiedenen Situationen durchführen und entsprechende Parameter optimieren, Experimente so planen, dass sie die gewünschten Ergebnisse erzielen, ohne In-vitro-Verfahren wiederholen zu müssen.

Der in dieser Studie entwickelte mathematische Rahmen kann umfassend in verschiedenen Bioprinting-bezogenen Studien für verschiedene Anwendungen wie Tissue Engineering, Onkologie und die pharmazeutische Industrie eingesetzt werden, indem seine Regeln erweitert und seine Fähigkeit verbessert werden, eine genaue Vorhersage biologischer Systeme zu liefern. Unser Modell kann durch die Einbeziehung bioinkbezogener Parameter wie Steifigkeit und strukturelle Integrität erweitert werden, die das Zellverhalten regulieren, einschließlich Proliferation und Migration sowie Sauerstoff-/Nährstoffdiffusion in das 3D-Netzwerk35,36,37,38,39.

Darüber hinaus kann das vorgeschlagene Modell in die Algorithmen des maschinellen Lernens integriert werden und bietet Forschern die Möglichkeit, die zeitliche oder strukturelle Wirkung des Hydrogelnetzwerks auf beliebige Ziele im biologischen System vorherzusagen. Darüber hinaus können wir die CA-Simulation verwenden, um den ML-Algorithmus vorab zu trainieren, und dann kann ein Transfer-Learning-Ansatz angewendet werden, um die experimentellen Daten zu trainieren.

Eine weitere Perspektive dieses Modells ist seine Anwendung in einer heterogenen Umgebung mit mehreren Zelllinien zur Untersuchung von Zell-Zell-Interaktionen und Zell-ECM-Interaktionen. Darüber hinaus kann dieses Modell durch Anpassung der Regeln in pharmakokinetische Modellierungstechniken integriert werden, um Arzneimittelbehandlungsreaktionen in 3D-Zellkulturen mithilfe von 3D-Bioprinting zu simulieren, um die Tumorentwicklung und -metastasierung, das Arzneimittelscreening und andere Aspekte der Krebsforschung zu untersuchen.

Letztendlich glauben wir, dass diese Arbeit oder ihre Kombination mit anderen Modellierungstechniken die Entwicklung des 3D-Biodrucks in der Zukunft erheblich beeinflussen und die Durchführung kostspieliger und zeitaufwändiger Experimente weitgehend vermeiden kann.

Bisher wurde ein optimales Nachdruckverhalten von Zellen, die im 3D-Biorin-Hydrogel wachsen, nur durch die Wiederholung mehrerer Experimente erreicht, die zeitaufwändig und teuer sind. Um diese Herausforderung zu meistern, haben wir ein CA-Modell entwickelt, um die Dynamik von Zellen nach dem Drucken innerhalb des 3D-Bioprint-Konstrukts zu simulieren. Zu diesem Zweck haben wir zunächst erfolgreich MDA-MB-231/Gelatine/Alginat-Bioink gedruckt und das Zellverhalten innerhalb von 11 Tagen mithilfe von MTT-, Live-Dead- und Ki-67-Zellproliferationstests bewertet. Mithilfe von In-vitro-Ergebnissen haben wir im CA-Modell Regeln für Zellproliferation, Lebensfähigkeit, Bewegung und Clusterbildung innerhalb des 3D-Hydrogelnetzwerks definiert und Modellparameter wie Verdoppelungszeit, Bewegungsgeschwindigkeit und Todeswahrscheinlichkeit in 11 Tagen kalibriert. Unser Modell kann das In-vitro-Verhalten von Zellen im 3D-Gerüst nach dem Drucken quantitativ erfassen und ist in der Lage, das Zellverhalten für verschiedene Bioprinting-Bedingungen vorherzusagen und aufzuklären. Es reproduziert beispielsweise die Zellbewegung und das Kriechen der Zellen in Richtung der Poren, gefolgt von der Bildung von Clustern nach sieben Tagen aufgrund der ungleichmäßigen Verteilung von Nährstoffen und Sauerstoff. Darüber hinaus verdeutlichen die In-silico-Daten die Abhängigkeit der Zellproliferation von der anfänglichen Zellzahl und der Kapazität des gedruckten Hydrogelnetzwerks und können die Zellproliferation nach dem Drucken auf der Grundlage der anfänglichen Zellmenge in der Biotinte vorhersagen. Dieses In-silico-Modell kann auch die Zellaktivität mithilfe verschiedener Netzwerkformulierungen darstellen, die Gelatine und Alginat enthalten. Der vorgeschlagene mathematische Rahmen kann für Forscher von Nutzen sein, um eine geeignetere Mikroumgebung für das Zellwachstum zu schaffen, ohne dass Experimente wiederholt werden müssen. Daher kann unser mathematischer Rahmen als einfallsreicher Schritt zur Weiterentwicklung von Bioprinting-bezogenen Studien angesehen werden.

Das Alginsäure-Natriumsalz, Dimethylsulfoxid (DMSO), Natriumchlorid, Calciumchlorid (CaCl2) und Gelatine aus Rinderhaut (Typ B) wurden von Sigma-Aldrich (Kanada) bezogen. Für Zellkulturstudien wurden MDA-MB-231 von ATCC, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), FBS (fötales Rinderserum), Penicillin/Streptomycin, Trypsin/EDTA-Lösung bei 0,25 % (Gew./Vol.) und Phosphat erworben Puffersalztabletten (PBS) wurden von Wisent Bioproducts gekauft. (3-(4,5-Dimethyl-2-thiazol)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid) MTT-Pulver, Triton X-100, BSA (Rinderserumalbumin) und Paraformaldehyd wurden von Sigma-Aldrich (Kanada) gekauft ). Darüber hinaus wurde von Sigma-Aldrich (Kanada) ein Assay-Kit für die Lebensfähigkeit lebender/toter Zellen (CBA415) und Hoechst 33342Nuclei Dye bereitgestellt. Zusätzlich wurden Anti-Ki67-Antikörper (ab15580) und Alexa Fluor 546 Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H + L) von Abcam bzw. Invitrogen (Kanada) erworben.

MDA-MB-231-Zellen wurden in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % 100 Uml – 1Penicillin/Streptomycin, in T-75-Flaschen kultiviert. Die Zellen wurden bei 5 % CO2 und 37 °C inkubiert und das Medium jeden zweiten Tag ausgetauscht. Als die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreichten, wurden die Zellen zweimal mit DPBS gespült und dann mit Trypsin/EDTA (0,25 % – 1X) suspendiert.

Zur Herstellung von Bioink wurde gemäß dem Protokoll von Ouyang et al.38 zunächst eine 0,5 %ige NaCl-Lösung mit entionisiertem Wasser hergestellt. Dann wurden Gelatine und Alginsäure-Natriumsalzpulver zugegeben und die Lösung 1 Stunde lang kräftig gerührt. Die vorbereitete Lösung wurde durch dreimaliges Erhitzen auf 70 °C (30 Minuten, dreimal) sterilisiert und dann vor der Verwendung bei 4 °C aufbewahrt. Vor dem Bioprinting wurde die MDA-MB-231-Suspension vorsichtig und gleichmäßig mit der vorbereiteten Gelatine-/Alginatlösung unter Verwendung einer Mischspritze gemischt, um einen Bioink mit Endkonzentrationen von 4 % (\(w/v\)) Gelatine, 4 % (\) herzustellen. (w/v\)) Alginat und 2–2,5 × 1 \({0}^{6}\) MDA-MB-231-Zellen \({\mathrm{mL}}^{-1}\).

Das Bioprinting wurde mit dem extrusionsbasierten Bioprinter CELLINK INCREDIBLE + durchgeführt. Die vorbereitete Biotinte wurde mit einer Nadel extrudiert, um die 3D-Zell-Hydrogel-Schichtgitterkonstrukte herzustellen. Genauer gesagt handelte es sich bei der für dieses Experiment verwendeten Druckdüse um eine konische Standarddüse (22G) und die Bewegungsgeschwindigkeit der Nadel wurde auf 5 \(mm{s}^{-1}\) eingestellt. Der Druck erfolgte bei Raumtemperatur unter Anwendung eines entsprechenden Drucks. Die Struktur wurde mit der Solidwork-Software entworfen und mit der Sli3r-Software in 10 Schichten mit der Größe \(10\times 10\times 3 m{m}^{3}\) mit einem geradlinigen Füllmuster geschnitten. Während des Druckens haben wir uns bemüht, den Druck auf dem geringsten Niveau zu halten, um die Lebensfähigkeit der Zellen möglichst wenig zu beeinträchtigen. Anschließend wurden die zellbeladenen Konstrukte in 3 % (\(w/v\)) sterile Calciumchloridlösung (20 Minuten) getaucht, um Natriumalginat mit Calciumionen zu vernetzen21. Anschließend wurde jede Struktur nach dreimaligem Waschen mit PBS in DMEM-Medium mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin in einer Platte mit 12 Vertiefungen kultiviert und bei 5 % CO2 und 37 °C für einen vorgegebenen Zeitraum inkubiert. Das Kulturmedium wurde jeden zweiten Tag ausgetauscht.

Die Zellproliferation innerhalb des 3D-Netzwerks wurde mithilfe des MTT-Assays untersucht. Nach vorgegebenen Tagen der Inkubation wurde das Medium in jeder Vertiefung einer Platte mit 12 Vertiefungen, die eine 3D-Struktur enthielt, entfernt und 900 µL frisches Medium und 100 µL MTT-Lösung (0,5 µL) hinzugefügt. {\mathrm{mg }mL}^{-1}\) in PBS) wurde in jede Vertiefung gegeben und die Platte wurde 4 Stunden lang bei 37 °C in einem \({\mathrm{CO}}_{2 }\) Inkubator. Die Kontrolle war eine 3D-Struktur ohne Zellen. Dann, nach dem Absaugen des Mediums, wurde 1 ml DMSO in jede Vertiefung gegeben, um gebildete Formazankristalle 30 Minuten lang bei 37 °C in einem \({\mathrm{CO}}_{2}\)-Inkubator aufzulösen . Am Ende wurde die Intensität der solubilisierten Formazankristalle mit dem Absorbance Microplate Reader bei 540 nm aufgezeichnet.

Die 3D-biogedruckten zellbeladenen Konstrukte wurden zu bestimmten Zeitpunkten mit dem Live/Dead-Färbe-Lebensfähigkeitskit basierend auf den Anweisungen des Herstellers gefärbt, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Kurz gesagt, jedes Konstrukt wurde dreimal in PBS gewaschen. Dann wurden 1 μM Calcein-AM und 2 μM Propidiumiodid auf die Färbezellen aufgetragen, während sie im Dunkeln inkubiert wurden. Zur Abbildung der lebenden und toten Zellen innerhalb der 3D-Konstrukte an mehreren Stellen wurde ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop (Zeiss LSM 700) verwendet. Anschließend wurden die Bilder mit der ImageJ-Software analysiert. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde gezählt, indem die Anzahl der grünen (lebenden) Zellen durch die Gesamtzahl der Zellen in jedem Bild dividiert wurde.

Der Ki-67-Zellproliferationsassay ist eine quantitative Technik zur Bewertung der Zellproliferation in vitro. Bei dieser Methode wird das Ki-67-Protein als Marker für die Zellproliferation eingesetzt, da es während des aktiven Zellzyklus (G1, S, G2 und M), aber nicht in der stationären Phase (G0) exprimiert wird. Für diesen Aufsatz wurde zunächst das Medium jeder Vertiefung in vorgegebenen Zeitschritten vollständig entfernt und jedes Gerüst wurde zweimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen durch einstündiges Inkubieren der Gerüste in 4 % Paraformaldehyd in PBS bei Raumtemperatur fixiert. Fixierte Strukturen wurden in PBS mit 0,1–0,25 % Triton X-100 für 15 Minuten permeabilisiert, nachdem sie zweimal mit PBS gewaschen wurden. Anschließend wurden die Zellen 1 Stunde lang mit 3 % BSA/0,1 % Triton \) in PBS/1 % BSA und Inkubation über Nacht bei 4 °C. Anschließend wurden die 3D-Strukturen dreimal 5 Minuten lang mit PBS/1 % BSA gewaschen, bevor der Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper (H + L) hinzugefügt und 2 Stunden lang inkubiert wurde. Anschließend wurden die Strukturen erneut mit PBS/BSA gewaschen (zweimal je 5 Minuten), bevor Hoechst 33.342 zugegeben wurde (Inkubationszeit von 1 Stunde). Abschließend wurden die Zellen mit dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop abgebildet.

Dieses Modell simuliert die Zeit als diskrete, gleichmäßige Zeitschritte; Jeder Zeitschritt beträgt 1 Stunde und jede Simulation dauert 11 Tage. In diesem Modell wird eine Teildomäne des porösen, mit Zellen beladenen Gerüsts simuliert, das mithilfe der 3D-Bioprinting-Methode hergestellt wurde und ein quadratisches Gitter aus 190 \(\times \) 190 \(\times 30\) Gitterpunkten umfasst, das symmetrisch aus vier Poren besteht mit Breiten von 50 \(\times \) 50 \(\times 30\) Gitterpunkten. Jeder Gitterpunkt innerhalb des Hydrogels kann von einer Zelle besetzt sein oder frei bleiben, während die Gitterpunkte in den Poren unbesetzt bleiben sollten, da die Zellen in den entsprechenden In-vitro-Experimenten nicht in die Poren wandern (Ergänzungsmaterial, Abbildung S2). . Eine Simulation wird instanziiert, indem eine bestimmte anfängliche Anzahl von Zellen an zufälligen Stellen auf dem Gitter innerhalb des Hydrogels platziert wird. Bei jedem Zeitschritt verhalten sich Zellen gemäß einer Reihe stochastischer Regeln, die zelluläre Prozesse wie Proliferation, Bewegung und Tod beschreiben. Der Hauptalgorithmus und der Zeitplan der Prozesse innerhalb jedes Zeitschritts beim Bioprinting sind in Abb. 9 dargestellt. Der Berechnungsrahmen baut auf früheren theoretischen Arbeiten zur Zellpopulation auf40,41. Eine detaillierte Modellbeschreibung, formuliert unter Verwendung des ODD-Protokolls (Overview, Design Concepts and Details), finden Sie im Ergänzungsmaterial (Ergänzungsmaterial, In-silico-Studien).

Hauptschritte beim In-vitro- und In-silico-Bioprinting.

Dieser Prozess wird für jede Zelle einzeln simuliert, um Variationen zwischen den Zellen zu berücksichtigen. Einzelne Zellen zeichnen sich durch eine spezifische, stochastische Verdopplungszeit aus, die auf die Zeit zurückzuführen ist, die jede Zelle benötigt, um einen Zellzyklus zur Teilung abzuschließen. Basierend auf unseren experimentellen Daten wird die Verdopplungszeit für jede Zelle aus einer Normalverteilung mit einem Wert µ = 96 h und einer Standardabweichung σ = 6 h ausgewählt. Der modellierte Zellzyklusprozess bei der Proliferation besteht aus Übergängen zwischen proliferativen und nicht-proliferativen (G0) Phasen. Nach der Teilung bleiben die Elternzellen an ihrer aktuellen Position und Tochterzellen können an einem unbesetzten Gitterpunkt in der Nähe der Elternzellen platziert werden. Wenn alle benachbarten Standorte bereits besetzt sind, treten die Elternzellen in die G0-Phase ein, die als Ruhe- oder Ruhephase bekannt ist und in der die Zellen inaktiv werden42. Für die Platzierung von Tochterzellen werden Moore-Nachbarschaften erster, zweiter und dritter Ordnung verwendet. Das Gerüst hat eine spezifizierte maximale Tragfähigkeit \(C\), um Zellen aufzunehmen, und wenn die Gesamtzahl der Zellen diese Kapazität erreicht, wird die Proliferation mit einer spezifizierten Wahrscheinlichkeit (\({P}_{0}\)) abgebrochen. Die Tragfähigkeit hängt von räumlichen und Nährstoffbeschränkungen im In-vitro-System ab. Die Werte von \(C\) und \({P}_{0}\) werden entsprechend den In-vitro-Beobachtungen kalibriert. Aufgrund der ungleichen Verteilung von Nährstoffen und Sauerstoff innerhalb des Gerüsts können sich einige Zellen auch nach Erreichen der Tragfähigkeit des Gerüsts noch vermehren, während andere in die G0-Phase eintreten. Das bedeutet, dass Zellen sich an Stellen mit ausreichend Nährstoffen und freien benachbarten Gitterpunkten weiter vermehren können. Tabelle S1 enthält die Werte für alle In-silico-Parameter.

Im Bewegungsprozess bewegen sich Zellen zu jedem bestimmten Zeitpunkt, bekannt als \({m}_{c}\). Da jedoch möglicherweise nicht alle Zellen in ihrer Bewegung synchronisiert sind, wurde eine Zufallszahl eingeführt, die zu \({m} hinzugefügt wird. _{C}\). Der Wert des Parameters \({m}_{c}\) wurde ebenfalls mithilfe von In-vitro-Daten kalibriert. Dabei können sich einzelne Zellen zufällig mit Zufallswahrscheinlichkeit oder voreingenommen-zufällig mit voreingenommener Wahrscheinlichkeit bewegen und ihre Position ändern, wenn in ihrer Nachbarschaft ein freier Gitterpunkt vorhanden ist34. Zellen können sich mit gleicher Wahrscheinlichkeit in eine von sechs Richtungen (rechts, links, oben, unten, vorwärts und rückwärts) ihrer Nachbarschaft bewegen, was als zufällige Bewegung bezeichnet wird, oder sich mit gewichteter Wahrscheinlichkeit auf voreingenommene zufällige Weise bewegen, wobei Zellen werden von anderen Zellen und den Poren in ihrer Nähe angezogen, wie durch empirische Beobachtungen aus den In-vitro-Experimenten motiviert. Bei der voreingenommenen Zufallsbewegung berechnen wir die Wahrscheinlichkeit einer Bewegung in jede Richtung (Richtung-p) in Abhängigkeit von der Anzahl benachbarter Zellen in dieser Richtung einer Zelle innerhalb ihres Anziehungsbereichs, definiert als (\({L}_{ C}\)). Außerdem kann die Wahrscheinlichkeit in jede Richtung abhängig vom euklidischen Abstand zwischen dem Individuum und den Poren innerhalb eines bestimmten Anziehungsbereichs, bekannt als (\({L}_{p}\)), erhöht werden. Im Fall der zufälligen Bewegung ist \({P}_{\mathrm{up}}={P}_{\mathrm{down}}={P}_{\mathrm{left}}={P}_{\ mathrm{rechts}}={P}_{\mathrm{vorwärts}}={P}_{\mathrm{rückwärts}}=1/6\), wobei 6 die Anzahl der Richtungen ist und \({P} _{\mathrm{oben}}\), \({P}_{\mathrm{unten}}\), \({P}_{\mathrm{links}}\) \({P}_{\ mathrm{right}}\) , \({P}_{forward}\) , und \({P}_{\mathrm{backward}}\) sind die Wahrscheinlichkeit der Zellbewegung nach oben, unten, links und jeweils die richtige Richtung. Im zufallsverzerrten Fall ist \({P}_{\mathrm{up}}={P}_{1}\), \({P}_{\mathrm{down}}={P}_{ 2}\), \({P}_{\mathrm{right}}={P}_{3}\), \({P}_{\mathrm{left}}={P}_{4} \), \({P}_{vorwärts}={P}_{5}\) und \({P}_{rückwärts}={P}_{6}\), mit \({\sum }_{i=1}^{6}{P}_{i}=1\). Die Wahrscheinlichkeiten \({P}_{i}\) werden durch Scannen und Summieren der benachbarten Zellen und Porengitterpunkte berechnet. Weitere Einzelheiten sind im Zusatzmaterial beschrieben. Schließlich bewegt sich jede Zelle mit größerer Tendenz in die Richtung, in der die höhere Wahrscheinlichkeit berechnet wird.

In den Simulationen gingen wir davon aus, dass die poröse Struktur des 3D-Bioprint-Gerüsts allen Zellen den Zugang zu Nährstoffen und Sauerstoff ermöglichte, was den Tod aufgrund des Mangels an solchen lebenswichtigen Materialien verhinderte. Zellen verlieren jedoch ihre Lebensfähigkeit, wenn sie länger als eine bestimmte Zeit in der stationären Phase verbleiben, die als \({C}_{d}\ definiert ist), kalibriert innerhalb eines Wertebereichs, mit der Wahrscheinlichkeit von \({P}_ {D}\). Tabelle S1 enthält die Werte für alle In-silico-Parameter.

Zur Analyse der Bilder wurde die Image J-Software verwendet. Alle Fehlerbalken in den Abbildungen und gemeldeten Daten zeigten ± SD bei mindestens drei Wiederholungen (n ≥ 3). Die Ergebnisse wurden im Format Mittelwert ± SD angegeben. Die gemeldeten Statistiken aus konfokalen Mikroskopbildern wurden durch Mittelung der Anzahl der Zellen an mindestens fünf verschiedenen Punkten jeder Struktur ermittelt.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor, Dorsa Mohammadrezaei, erhältlich.

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Wir danken den Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (DM, MK) für die finanzielle Unterstützung.

Abteilung für Angewandte Mathematik, University of Waterloo, 200 University Ave West, Waterloo, ON, N2L 3G1, Kanada

Dorsa Mohammadrezaei, Nafiseh Moghimi, Shadi Vandvajdi und Mohammad Kohandel

Fakultät für Mathematik, Fakultät für Naturwissenschaften und Technik, Swansea University, Swansea, Großbritannien

Gibin Powathil

Fakultät für Mathematik und Statistik, University of St Andrews, St Andrews, Großbritannien

Sara Hamis

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DM: Konzipierte und gestaltete die Analyse, entwickelte den In-silico-Code, führte und analysierte die In-vitro- und In-silico-Experimente und verfasste das Manuskript. NM: hat die In-vitro-Experimente beraten. SV: In-silico-Experimente durchgeführt. GP: Konzipierte und gestaltete die Analyse, beriet das Projekt und überarbeitete das Manuskript. SH: Konzipierte und gestaltete die Studie, beriet die In-silico-Experimente, entwickelte den Rechenrahmen und überarbeitete das Manuskript. MK: Konzipierte und gestaltete die Analyse, betreute das Projekt und überarbeitete das Manuskript.

Korrespondenz mit Dorsa Mohammadrezaei.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Ergänzende Informationen 1.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Mohammadrezaei, D., Moghimi, N., Vandvajdi, S. et al. Vorhersage und Aufklärung des Post-Printing-Verhaltens von 3D-gedruckten Krebszellen in Hydrogelstrukturen durch Integration von In-vitro- und In-silico-Experimenten. Sci Rep 13, 1211 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-28286-9

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Eingegangen: 13. August 2022

Angenommen: 16. Januar 2023

Veröffentlicht: 21. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-28286-9

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