3D-Bioprinting mit einem neuen Foto

npj Regenerative Medicine Band 8, Artikelnummer: 18 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Dreidimensionales (3D) Bioprinting ist eine hochwirksame Technik zur Herstellung zellbeladener Konstrukte im Tissue Engineering. Allerdings ist die Vielseitigkeit der Herstellung präziser und komplexer zellbeladener Hydrogele aufgrund der schlechten Vernetzungsfähigkeit zellhaltiger Hydrogele begrenzt. Hier schlagen wir einen fasergestützten Bioprinting-Prozess (OAB) vor, um methacrylierte Hydrogele effizient zu vernetzen. Durch Auswahl geeigneter Verarbeitungsbedingungen für die Photovernetzungstechnik stellten wir biofunktionale zellbeladene Strukturen her, darunter methacrylierte Gelatine (Gelma), Kollagen und dezellularisierte extrazelluläre Matrix. Um die Methode auf die Regeneration der Skelettmuskulatur anzuwenden, wurden zellbeladene Gelma-Konstrukte mit einer funktionellen Düse mit einem topografischen Hinweis und einem OAB-Prozess verarbeitet, der eine uniaxiale Ausrichtung von C2C12 und menschlichen Fettstammzellen (hASCs) induzieren konnte. In der zellbeladenen Gelma-Struktur wurden deutlich höhere Grade der Zellausrichtung und myogenen Aktivitäten beobachtet als in dem Zellkonstrukt, das mit einer herkömmlichen Vernetzungsmethode gedruckt wurde. Darüber hinaus wurde in einem Mausmodell ein in vivo-regeneratives Potenzial bei volumetrischen Muskeldefekten beobachtet. Das hASC-beladene Konstrukt induzierte eine signifikant stärkere Muskelregeneration als das Zellkonstrukt ohne topografische Hinweise. Basierend auf den Ergebnissen kann sich das neu entwickelte Bioprinting-Verfahren als äußerst effektiv bei der Herstellung biofunktionaler zellbeladener Konstrukte für verschiedene Anwendungen im Tissue Engineering erweisen.

Kürzlich wurden zellbeladene Gerüste, die natürliche komplexe Gewebestrukturen nachahmen, mithilfe einer Vielzahl von Bottom-up-Methoden hergestellt, wie z. B. elektrohydrodynamischen, mikrofluidischen, foto- oder weichlithografischen und dreidimensionalen (3D) Bioprinting-Verfahren1,2,3. 4,5. Aufgrund der effizienten Produktionsfähigkeit von Mehrschichttechniken hat das 3D-Bioprinting-Verfahren breite Anwendung in Tissue-Engineering-Anwendungen gefunden. Insbesondere vielseitige Anwendungen verschiedener Bioinks wurden umfassend erforscht6,7,8,9.

Bisher wurden viele vielversprechende Ergebnisse bei der Entwicklung von durch Gewebezüchtung hergestellten Skelettmuskeln mit verbesserten Funktionen ohne Bioprinting erzielt10,11. Ein bemerkenswerter Nachteil von durch Gewebezüchtung hergestellten Skelettmuskelkonstrukten ohne Bioprinting ist jedoch die Unzulänglichkeit, patientenspezifische Geometrien herzustellen. Um dieses Problem zu lösen, sollten verschiedene Parameter berücksichtigt werden, darunter Drucktemperatur, pneumatischer Druck, Druckgeschwindigkeit und der Vernetzungsprozess zur Herstellung von 3D-Zellkonstrukten mit geeigneten biologischen Aktivitäten, wie z. B. hoher Zelllebensfähigkeit/-proliferation und phänotypischer Differenzierung/Reifung der gedruckten Zellen .

Düsenbasierte Extrusionsverfahren weisen jedoch mehrere Mängel auf, wie z. B. eine begrenzte Auflösung der Strebengröße, eine eingeschränkte Zelldichte zellbeladener Streben und eine geringe Druckbarkeit, die auf die schwache mechanische Beschaffenheit zellbeladener Hydrogele zurückzuführen ist. Mehrere fortschrittliche, mit Ionen konjugierte Bioinks wurden eingeführt, um Zellkonstrukte zu erhalten; Die Herstellung mechanisch stabiler zellbeladener Strukturen mithilfe der 3D-Drucktechnologie bleibt jedoch eine Herausforderung, die es bei der Drucktechnik und dem Bioink-Bildungsprozess zu bewältigen gilt8,12,13.

Um die Mängel zellbeladener Streben, die mithilfe eines 3D-Druckverfahrens erhalten wurden, zu überwinden, wurden kürzlich mehrere Vernetzungsstrategien vorgeschlagen, darunter In-situ-Fotovernetzungsverfahren in Kombination mit Drucken.8,14,15. Beispielsweise erfordert die Herstellung mechanisch stabiler, mit Zellen beladener Filamente im Mikromaßstab Druckprozesse, bei denen ein Kern/Schale-Düsensystem zum Einsatz kommt, bei dem die Alginat-Biotinte im Schalenbereich sofort mit einer Calciumchloridlösung vernetzt wird, die die fotovernetzte, mit Zellen beladene methacrylierte Gelatine schützt (Gelma) im Kern16,17. Darüber hinaus wurden in ähnlichen Studien Fasern mit zellbeladenem Kern (Gelma)/Hülle (Natriumalginat) mithilfe eines Mikrofluidikkanals hergestellt, in dem mit Endothelzellen beladenes Gelma im Kern entwickelt wurde18. Darüber hinaus wurde eine In-situ-Vernetzungsmethode unter Verwendung einer transparenten koaxialen Kapillardüse, die mit einem 3D-Drucker verbunden ist, eingeführt, um stabile gedruckte Strukturen (Mikrogitter und Hohlröhren) zu erhalten, ohne von der Bioink-Viskosität abhängig zu sein8.

Die vorgeschlagenen Druckverfahren haben eindeutig fortgeschrittene Ergebnisse bei der Erzielung zellbeladener 3D-Mikrofaserstrukturen gezeigt, die die intrinsischen Morphologien und Biofunktionen echter Fasergewebe nachahmen; Die Methoden verwenden jedoch begrenzte Biotinte (dh die Verwendung von schnell vernetzbarem Alginat in Calciumionen), um zellbeladene bioaktive Materialien zu unterstützen. Darüber hinaus lässt sich für in situ photovernetzbare Systeme aufgrund des kaum photovernetzten Schalenbereichs der fließenden methacrylatierten zellbeladenen Hydrogele nicht einfach eine realistische mehrschichtige 3D-Struktur erhalten, und es ist eine speziell transparente und hydrophobe Düse erforderlich.

Um diese Herausforderungen früherer Drucksysteme anzugehen, präsentieren wir eine neue Fotovernetzungsstrategie in Kombination mit einem Druckprozess, um mechanisch stabile Strukturen und realistische mehrschichtige zellbeladene Strukturen herzustellen. Zu diesem Zweck verwendeten wir eine in eine allgemeine Druckdüse eingebettete optische Faser, um fließende methacrylierte Hydrogele (methacrylierte Gelatine, Kollagen und dezellularisierte extrazelluläre Matrix (dECM)) stabil fotovernetzen. Unter Verwendung dieses einzigartigen Vernetzungssystems wurden mechanisch stabile und biologisch sichere zellbeladene Streben und eine mehrschichtige 3D-zellbeladene Struktur mit angemessener Haftkraft zwischen zellbeladenen Filamenten effektiv hergestellt. Um die Vielseitigkeit des Photovernetzungsprozesses zu nutzen, wurden zellbeladene Streben mit Oberflächenmikromuster unter Verwendung von C2C12 und menschlichen Fettstammzellen (hASCs), die mit einer oberflächengerillten Kunststoffdüse bearbeitet wurden, für die Regeneration von Muskelgewebe hergestellt. Die Zellkonstrukte mit einem einachsig gerillten Oberflächenmuster zeigten eine verbesserte myogene Differenzierung aufgrund der Zellausrichtung, die durch die Kombination der gerillten Oberfläche in der Düse und des In-situ-Glasfaser-unterstützten Vernetzungsprozesses erreicht wurde. Darüber hinaus wurden die biogedruckten hASC-Konstrukte bei einer volumetrischen Muskeldefektverletzung bei Mäusen eingesetzt und zeigten eine deutlich verbesserte Muskelregeneration im Vergleich zu denen, die mit einem herkömmlichen Bioprinting-Verfahren hergestellt wurden.

Im Allgemeinen werden photovernetzbare Biotinten, wie z. B. methacrylierte Hydrogele auf der Basis von Gelatine, Kollagen, Hyaluronsäure und dezellularisierter extrazellulärer Matrix, aufgrund ihrer hervorragenden Zellverkapselungsfähigkeiten und kontrollierbaren mechanischen Eigenschaften häufig zur Herstellung zellbeladener Konstrukte verwendet kann mithilfe verschiedener Photovernetzungsverfahren effektiv erreicht werden9,19,20,21,22. Wenn fotovernetzbare Biotinten mit einem allgemeinen Bioprinting-Verfahren kombiniert werden, können mehrschichtige zellbeladene Konstrukte mit anpassbaren Porengeometrien erfolgreich hergestellt werden. Die präzise und stabile Bildung von Zellkonstrukten, die mithilfe von Bioprinting, ergänzt durch einen Photovernetzungsprozess, hergestellt werden, hängt jedoch entscheidend vom verwendeten Vernetzungsansatz ab. Von den verschiedenen Vernetzungsstrategien, die mit Bioprinting kombiniert werden, ist die „In-situ-Photovernetzungsmethode“ die bahnbrechendste Strategie, die unter Verwendung einer transparenten hydrophoben Silikondüse ausgeführt wird und die Scherspannung einer fließenden photovernetzten Biotinte senken kann8. Wenn die Biotinte durch die Düse läuft, kann UV-Licht direkt auf die transparente Düse gerichtet werden, um die fließende photovernetzbare und niedrigviskose Biotinte zu vernetzen. Diese Methode ist von immenser Bedeutung, da sie niedrigviskose Bioinks effektiv und stabil vernetzt, um mechanisch stabile zellbeladene Streben zu erhalten. Der In-situ-Fotovernetzungsprozess erfordert jedoch eine speziell entwickelte transparente und hydrophobe lichtdurchlässige Düse. Da außerdem die Oberfläche der zellbeladenen Streben aktiver vernetzt werden kann als der Kernbereich der gedruckten Streben, kann die Klebeeigenschaft zwischen den Streben nach der Herstellung von 3D-Zellstrukturen relativ schlecht sein, was zu einer geringen 3D-Strukturformbarkeit führt .

Um die Mängel der In-situ-Vernetzung fotovernetzbarer Biotinten zu überwinden, haben wir eine neue Vernetzungsmethode entwickelt, bei der ein fasergestützter 3D-Bioprinting-Prozess (OAB) zum Einsatz kommt, der sich völlig von dem herkömmlichen Bioprinting (CB) unterscheidet, bei dem ein In-situ-Vernetzungsprozess zum Einsatz kommt ( Abb. 1a–c). Um die Leistung des OAB-Prozesses zu bewerten, wählten wir einen photovernetzbaren Bioink auf Gelma-Basis, der mit C2C12-Myoblasten mit einer Dichte von 1 × 107 Zellen/ml beladen ist. Dies liegt daran, dass Gelma als typischer photovernetzbarer Bioink mit biokompatiblen und biologisch abbaubaren Eigenschaften angesehen werden kann und in großem Umfang in Gerüsten für die Gewebezüchtung, Arzneimittelabgabesystemen und Heilungssubstraten von Wundregionen eingesetzt werden kann23,24,25. Um die Biotinte effizient zu vernetzen, wurde eine optische Faser in eine allgemeine Druckdüse eingebettet, und durch Steuerung der Intensität einer UV-Lichtquelle (UV-Spot-Kopf, dargestellt in Abb. 1d) konnten wir ein mechanisch stabiles und biologisch sicheres 3D erhalten zellbeladenes Konstrukt, wie in den optischen und lebenden (grün)/toten (rot) Bildern in Abb. 1a und dem optischen Bild der gedruckten Gelma-Netzstruktur (Abb. 1c) dargestellt. Abbildung 1a, c zeigt ein optisches Bild von UV-Licht, wie es durch die in die Düse eingeführte optische Faser beobachtet wird. Um einen Temperaturanstieg der Biotinte durch die optische Faser zu vermeiden, wurde außerdem ein Kühlwassermantel (4 °C) um die Druckdüse angebracht (Abb. 1c, d). Im Vergleich zur herkömmlichen Nachvernetzung können mit dem vorgeschlagenen OAB-Prozess zellbeladene 3D-Strukturen mit intrinsischen Morphologien erhalten werden, wie die verbesserten Zirkularitätswerte zeigen (ergänzende Abbildung 1). Darüber hinaus kann die OAB-Methode im Gegensatz zur CB-Methode aufgrund der verbesserten Streben-zu-Streben-Haftung eine realistische mehrschichtige 3D-Struktur herstellen.

ein Schema eines optisch unterstützten Bioprinting-Prozesses (OAB), bei dem eine optische Faser in einer Düse eines Druckers platziert wird, sowie optische und lebende (grün)/tote (rot) Bilder der gedruckten C2C12-beladenen Gelma-Strebe. b Schematische Darstellung eines photovernetzten Hydrogels in einer Düse, verarbeitet mit dem OAB- und CB-Verfahren. c, d OAB-System, verbunden mit einem Wasserkühlmantel, Querschnittsdruckdüsenbild und einem optischen Bild einer gedruckten, mit Netzzellen beladenen Gelma-Struktur.

Um die Wirkung des OAB-Prozesses auf die Photovernetzungsfähigkeit des Gelma-Bioinks zu beobachten, wurden 5 Gew.-% Gelma verwendet. Abbildung 2a zeigt den Speichermodul (G′) des Gelma-Bioinks im Time-Sweep-Modus vor und nach der UV-Exposition (UV-Dosis = 120 mJ/cm2 für 10 s). Wie erwartet wurde die Steifigkeit von Gelma, das UV-Licht ausgesetzt war, nach der UV-Bestrahlung deutlich erhöht.

ein Speichermodul (G′) von 5 Gew.-% Gelma, erhalten aus Zeitdurchlauftests, die vor und nach der UV-Exposition durchgeführt wurden (UV-Dosis = 120 mJ/cm2 für 10 s). b Farbänderung in der Mischung aus 5 Gew.-% Gelma und Phenolrot bei verschiedenen UV-Dosen. c Optische Querschnittsbilder der gedruckten Gelma/Phenolrot-Streben, die mit herkömmlichen Bioprinting- (CB) und OAB-Verfahren hergestellt wurden, die Verteilung des Grauwerts unter Verwendung der Querschnittsbilder für den Radius und die Differenz der Grauwerte in der Mitte und Randbereiche. d Optische Bilder gedruckter Gelma-Netzstrukturen nach dem In-situ-Drucken, während des Schüttelns und nach dem Schütteln zur Veranschaulichung der strukturellen Stabilität. e Schertest der mit CB und OAB verarbeiteten bedruckten Netzstrukturen zur Beobachtung der Klebeeigenschaften zwischen den Streben. f Zugspannungs-Dehnungs-Kurven und Elastizitätsmodul der gedruckten Gelma-Strukturen. Alle Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die p-Werte wurden durch den Schüler-t-Test berechnet (n = 3/Gruppe; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001). Maßstabsbalken, 200 µm (c); 1 mm (d).

Um den Effekt der Photovernetzung zu beobachten, die durch die im Inneren der Düse platzierte optische Faser auf die Vernetzungsverteilung über die Querschnittsfläche einer Gelma-Strebe erzeugt wird, haben wir die Verteilung der roten Farbintensität von Phenolrot gemessen. die je nach Photovernetzungsgrad unterschiedlich waren. Abbildung 2b zeigt die verschiedenen Intensitäten der roten Farbe für die Mischung aus 5 Gew.-% Gelma/Phenolrot (150 mg/L) bei verschiedenen UV-Dosen (0, 60 und 120 mJ/cm2), was darauf hinweist, dass die rote Farbe verblasst ist bei zunehmender UV-Dosis in Weiß umgewandelt. Abbildung 2c zeigt zwei Querschnittsbilder von Gelma-Streben, die mit dem CB- bzw. OAB-Verfahren vernetzt wurden. Bei den Druck-/Vernetzungsprozessen betrugen die Größe der Druckdüse, die Düsengeschwindigkeit, der pneumatische Druck und die UV-Dosis 700 μm, 1 mm/s, 120 ± 10 kPa bzw. 120 mJ/cm2.

Die Verteilung der roten Farbe für die mit den CB- und OAB-Methoden hergestellten photovernetzten Gelatinestreben ist in Abb. 2c dargestellt. Wie aus den Ergebnissen hervorgeht, war die Querschnittsverteilung der grauen Farbe, die den Grad der Photovernetzung veranschaulicht, bei jeder Methode unterschiedlich. Beim CB-Prozess war die relative graue Farbverteilung im Querschnittsbereich der Gelma-Strebe am Radius ähnlich, wohingegen bei der mit dem OAB verarbeiteten Gelma-Strebe die Photovernetzung im Kernbereich relativ höher war als in der Schale Region (das Diagramm der Grauwertdifferenz in Abb. 2c). Aufgrund dieser Ergebnisse können wir davon ausgehen, dass der relativ geringe Vernetzungsgrad im Schalenbereich der Strebe die 3D-Strukturbildung mehrschichtiger gedruckter Filamente beeinflussen kann. Abbildung 2d zeigt gedruckte Netzstrukturen, die mit den CB- und OAB-Verfahren hergestellt wurden (5 Gew.-% Gelma, UV-Dosis = 120 mJ/cm2, Düsengröße = 700 μm, Düsenbewegungsgeschwindigkeit = 2 mm/s und pneumatischer Druck = 120 ± 10 kPa ). Nach der Herstellung der Gelma-Strukturen wurden die gedruckten Strukturen geschüttelt. Wie in den optischen Bildern gezeigt, wurde die 3D-Netzstruktur in den im CB-Verfahren hergestellten Gelma-Streben zerstört, wohingegen die im OAB-Verfahren hergestellte Gelma-Netzstruktur stabil in ihrer ursprünglich entworfenen Form erhalten blieb. Dieses Ergebnis zeigt, dass die mit dem OAB-Verfahren gedruckten Gelatinestreben gut aneinander hafteten, um die 3D-Strukturform aufrechtzuerhalten.

Um die Haftkraft zwischen den Gelma-Streben zu bewerten, haben wir die Verschiebung gegenüber der Last für Schertests gemessen (Abb. 2e). Folglich waren die Adhäsionsenergie zwischen den Gelma-Streben und die maximale Belastung der Grenzflächenkraft zwischen den im OAB-Verfahren hergestellten Gelma-Streben deutlich höher als bei den im CB-Verfahren verarbeiteten Gelma-Streben. Dies zeigte, dass die 3D-Strukturformationen, die aus mehrschichtigen Streben bestehen, die mit dem OAB-Verfahren gedruckt wurden, viel effizienter erhalten werden können als solche, die mit dem CB-Verfahren gedruckt wurden. Bei den Zugspannungs-Dehnungs-Kurven wies die mit CB verarbeitete Struktur jedoch einen deutlich höheren Elastizitätsmodul auf als die mit OAB gedruckte Struktur (Abb. 2f). Wir glauben, dass der Unterschied im Zugmodul auf den unterschiedlichen Grad der Vernetzungshomogenität innerhalb der Streben zurückzuführen sein könnte, wie in Abb. 2c dargestellt. Bei den mit dem OAB-Verfahren vernetzten Gelma-Streben konnte die von außen aufgebrachte Zugspannung stark auf den relativ gering vernetzten Bereich der Streben konzentriert werden, was zu einem geringeren Widerstand der Zugkraft im Vergleich zu den mit CB verarbeiteten homogen vernetzten Gelma-Streben führte.

Bestimmung des geeigneten Bereichs von Druckparametern (UV-Dosis und Verarbeitungstemperatur) unter einem festen Gelma-Gewichtsanteil (5 Gew.-%) und Druckbedingungen (Düsengröße = 700 μm, Düsenbewegungsgeschwindigkeit = 1 mm/s und pneumatischer Druck = 120). ± 10 kPa) wurde ein Einlinientest durchgeführt.

Zuerst haben wir die rheologischen Eigenschaften des 5 Gew.-%igen Gelma-Bioinks während Temperatur- und Zeitdurchläufen unter verschiedenen UV-Dosen (30, 90 und 150 mJ/cm2) gemessen. Wie erwartet zeigte der Gelma-Bioink für den Temperaturdurchlauf ein typisches Sol-Gel-Übergangsverhalten (Abb. 3a). Darüber hinaus steigerte die Erhöhung der UV-Dosis bei konstanter Temperatur (10 °C) den Vernetzungsgrad des Gelma-Bioinks (Abb. 3b).

Rheologische Eigenschaften von 5 Gew.-% Gelma, erhalten durch (a) Temperaturdurchlauf und (b) Zeitdurchlauf bei verschiedenen UV-Dosen. c Prozessdiagramm, das den Einfluss der Verarbeitungstemperatur und der UV-Dosis auf den Vernetzungsgrad gedruckter Gelma-Streben veranschaulicht (keine Vernetzung, unzureichende Vernetzung und stabile Vernetzung). d Optische Bilder der gedruckten Form von Gelma-Streben, verarbeitet über OAB bei verschiedenen UV-Dosen (0, 90 und 120 mJ/cm2) und optische Bilder der gedruckten Streben nach 7 Tagen Kultur. e Die-Quellverhältnisse (Durchmesser der gedruckten Strebe/Durchmesser der Düse) für verschiedene UV-Dosen. f Der Abbau gedruckter Gelma-Streben wurde anhand der Durchmesserdifferenz bestimmt, die vor und nach 7 Tagen Kultur beobachtet wurde. Maßstabsleiste, 1 mm (d – Strebe); 500 µm (d – kultiviert).

Um den Einfluss der Temperatur des Gelma-Bioinks auf den Photovernetzungsgrad zu beobachten, haben wir drei typische Verarbeitungstemperaturen ausgewählt: (1) Gelbereich: 10 °C, (2) Gel-Sol-Übergangsbereich: 20 °C und ( 3) Solbereich: 30 °C für verschiedene UV-Dosen (0–150 mJ/cm2). Bei der Temperatur des Solbereichs (30 °C) wurde unabhängig von der angewendeten UV-Dosis (0–150 mJ/cm2) keine stabile Photovernetzung der gedruckten Gelma-Strebe erreicht, wohingegen bei Gelma-Streben, die am Gel und am Gel-Sol gedruckt wurden, keine stabile Photovernetzung erzielt wurde Übergangstemperaturen und mit mehr als 60 mJ/cm2 UV-Dosen wurden vernetzte Gelma-Streben stabil gebildet (Abb. 3c). Der Photovernetzungsgrad von Gelma-Bioink für verschiedene Sol-Gel-Temperaturen stimmte mit dem in der von Chansoria et al.26 durchgeführten Studie überein. Ihren Untersuchungen zufolge hing der Kompressionsmodul von Gelma-Bioink nicht nur in hohem Maße von den UV-Bestrahlungsbedingungen, sondern auch von der Photovernetzungstemperatur ab; Der Modul stieg bei niedrigeren Vernetzungstemperaturen (Geltemperatur, 10 °C) von Gelma. Dieses Ergebnis wurde erzielt, weil die Photovernetzung der Gelma-Lösung bei niedrigen Temperaturen einen synergistischen Effekt eng verschlungener Polypeptidnetzwerke bei niedrigen Temperaturen und deren Photovernetzung durch kovalente Bindung induzieren konnte26.

Um die strukturelle Stabilität nach dem Photovernetzen/Drucken zu demonstrieren, haben wir außerdem das Düsenquellverhältnis (D1/D0, wobei D0 und D1 den Durchmesser der inneren Düse bzw. den Strebendurchmesser an der Düsenspitze angeben) und gemessen Veränderung der Querschnittsfläche der Gelma-Streben nach 7 Tagen in der PBS-Lösung. Abbildung 3d und ergänzende Abbildung 2a zeigen optische Bilder der gedruckten Gelma-Strebe in der Nähe der Druckdüse bei einer festen Drucktemperatur (10 °C) und verschiedenen UV-Dosen (0–120 mJ/cm2). Aufgrund des geringen Vernetzungsgrads von Gelma, das UV-Dosen von 0 und 30 mJ/cm2 ausgesetzt wurde, war das Quellverhältnis deutlich höher als das des gedruckten Gelma, das bei höheren UV-Dosen (90 und 150 mJ/cm2) vernetzt wurde (Abb. 3e). . Darüber hinaus nahm die Rundheit der extrudierten Strebe bis zu 120 mJ/cm2 deutlich zu, die weitere Erhöhung der UV-Dosis hatte jedoch keinen Einfluss auf die Rundheit (ergänzende Abbildung 2b). Darüber hinaus wurden die Strömungsgeschwindigkeit (ergänzende Abbildungen 2c, d) und der Abstand zwischen Glasfaser und Düsenauslass (ergänzende Abbildungen 2e, f) unter Verwendung einer festen UV-Dosis (120 mJ/cm2) untersucht. Infolgedessen hatte die Strömungsgeschwindigkeit vernachlässigbare Auswirkungen auf die Rundheit der extrudierten Streben, wohingegen der vergrößerte Abstand zwischen der optischen Faser und dem Düsenabstand die Rundheit verbessert hatte. Ein ähnliches Ergebnis wurde für das Degradationsverhalten (=[A0 − A1]/A0, wobei A0 und A1 die Querschnittsflächen der in situ gedruckten Streben bzw. die Fläche der Strebe nach 7 Tagen bezeichnen) der Gelma-Streben beobachtet (Abb. 3f). Bei UV-Dosen unter 90 mJ/cm2 erfolgte der Strebenabbau aufgrund unzureichender Vernetzungsgrade extrem schnell. Basierend auf den Ergebnissen der Strebenformung und -dimensionierung konnten wir geeignete Einstellungen für die UV-Dosis (120 mJ/cm2) auswählen.

Nachdem wir die UV-Dosis festgelegt hatten, untersuchten wir verschiedene Wassermanteltemperaturen (4, 10 und 20 ° C), wie in der ergänzenden Abbildung 3a, b dargestellt. Als Ergebnis zeigte die anhand von Rundheit und Oberflächenglätte gemessene Homogenität der extrudierten Strebe, dass die mit der relativ niedrigen Wassermanteltemperatur (4 °C) verarbeitete Strebe im Vergleich zu denen bei anderen Temperaturen eine deutlich höhere Rundheit und glattere Oberfläche aufwies. Dies kann darauf zurückgeführt werden, dass die gleichzeitige UV-Vernetzung von Gelma bei niedrigeren Temperaturen eine ausgeprägte strukturelle Stabilität induzieren kann27,28. Wenn die Temperatur des Wassermantels außerdem auf 4 °C eingestellt ist, wurde eine Drucktemperatur von 10 °C gemessen. Nach Festlegung der UV-Dosis und der Drucktemperatur wurde die Auswirkung des Gewichtsanteils von Gelma auf den Vernetzungsgrad beobachtet. Die ergänzende Abbildung 4a, b zeigt den Speichermodul für die drei Gewichtsanteile (3, 5 und 7 Gew.-%) des Gelma-Bioinks. Wie erwartet zeigten die Gelma-Bioinks einen ähnlichen Sol-Gel-Übergang für den Temperaturdurchlauf und eine Vernetzung unter einer festen UV-Dosis (120 mJ/cm2) und Drucktemperatur (10 °C) wurde erreicht. Nach Anwendung der UV- und festen Verarbeitungsbedingungen zeichneten wir die optischen Bilder auf und maßen das Quellverhältnis und die Verschlechterung der Gelma-Streben, die mit dem OAB-Verfahren gedruckt wurden (ergänzende Abbildung 4c – e). Für alle Konzentrationen des Gelma-Bioinks wurde ein Stumpfquellungsverhältnis von etwa 1 beobachtet; Bei der 3 Gew.-% Gelma-Bioink wurde jedoch eine unzureichende Vernetzung beobachtet (ergänzende Abbildung 4e). Basierend auf den Ergebnissen verwendeten wir für die weitere Bewertung eine Gelma-Konzentration von 5 Gew.-% und die folgenden Druckparameter: UV-Dosis = 120 mJ/cm2 und Drucktemperatur = 10 °C. Wie in der ergänzenden Abbildung 5 gezeigt, kann die Streuung des UV-Lichts innerhalb der Düse unter Verwendung der eingestellten Parameter eine Vernetzung im Kernbereich der extrudierten Strebe hervorrufen, wohingegen der Schalenbereich relativ weniger vernetzt ist. Basierend auf diesen Daten gehen wir sorgfältig davon aus, dass die optimierten Parameter im OAB-System die Herstellung mehrschichtiger 3D-Strukturen ermöglichen können.

In jüngster Zeit haben formverändernde Hydrogele oder 4D-Biofabrikationssysteme aufgrund der Möglichkeit der Biomimikry und der Bildung komplexer Mikroarchitekturen an Aufmerksamkeit gewonnen29,30,31. Um den OAB-Prozess auf die 4D-Herstellung verschiedener komplexer biologischer Architekturen zu erweitern, haben wir zwei optische Fasern (optische Faser-1 und optische Faser-2) in einer Düse befestigt, wie im schematischen Bild von Abb. 4a dargestellt. Im Bild kann beim Einschalten der optischen Faser 1 eine asymmetrische Photovernetzung der gedruckten Gelma-Struktur erreicht werden. Im Allgemeinen führt eine geringe Wasserquellung zu einer hohen elastischen Eigenschaft (≈hoher Vernetzungsgrad)32, so dass der Grad der asymmetrischen Vernetzung des Hydrogels die Richtung der Hydrogelkrümmung zu bestimmen scheint. Abbildung 4b beschreibt den Krümmungsmechanismus im Detail, und das optische Bild der Gelma-Strebe, die mithilfe des asymmetrischen Photovernetzungsprozesses hergestellt wurde, kann auf die asymmetrische Vernetzung der Strebe hinweisen. Abbildung 4c, d zeigen die Krümmungsfähigkeit der Gelma-Streben in Abhängigkeit von der Verwendung der optischen Fasern. Bei Einwirkung von Wasser lösten die asymmetrisch photovernetzten Gelma-Streben eine unterschiedliche Quellgeschwindigkeit aus, und aufgrund des unterschiedlichen Vernetzungsgrades kam es in der Querschnittsrichtung der Strebe zu unterschiedlichem Quellverhalten, wodurch spiralförmige und s-förmige Strukturen entstanden. Basierend auf dem nachgewiesenen Proof-of-Concept der 4D-Herstellung gehen wir sorgfältig davon aus, dass das OAB-System in verschiedenen biologischen Anwendungen wie der Blutgefäßbildung oder Nerventransplantationen eingesetzt werden kann.

a Optisches und schematisches Bild der asymmetrischen Photovernetzung unter Verwendung zweier optischer Fasern. b Formänderungsmechanismus der Gelma-Strebe und ein optisches Bild der hergestellten Gelma-Strebe. Krümmungsfähigkeit (c-Spirale und d-'s'-Kurvenbildung) der Gelma-Streben in Abhängigkeit von der asymmetrischen Vernetzung der Gelma-Streben. Maßstabsbalken, 100 µm (b); 5 mm (c, d).

Wie im vorherigen Abschnitt erwähnt, besteht einer der Vorteile des OAB-Verfahrens darin, dass fotovernetzbare Biotinten innerhalb der Düse vernetzt werden können, unabhängig von der Transparenz des Düsenmaterials und der Düsenkomplexität. Drei verschiedene Düsen (Glasdüse, undurchsichtige Kunststoffdüse und gequetschte Stahldüse) wurden verwendet, um die Machbarkeit des OAB-Prozesses unabhängig von der spezifischen Düsenkonstruktion zu demonstrieren. Wie in Abb. 5a dargestellt, wurde eine Glasdüse zum Extrudieren des Gelma-Bioinks verwendet, und die mit den CB- und OAB-Verfahren unter den zuvor eingestellten UV- und Druckbedingungen gedruckten Gelma-Streben zeigten eine völlig ähnliche zylindrische Form (Abb. 5b). Wenn jedoch das OAB-Verfahren unter Verwendung der in Abb. 5c gezeigten ellipsoiden Stahldüse eingesetzt wurde, wurde eine Gelma-Strebe mit einer Form erhalten, die der Form der Stahlquerschnittsdüse ähnlicher war als die mit dem CB-Verfahren gedruckte Strebenform (Abb. 5c, d).

a Optische Oberflächen- und Querschnittsbilder der gedruckten Gelma-Streben, verarbeitet über CB und OAB (UV-Dosis = 120 mJ/cm2) und b Zirkularität der Querschnittsbilder. c, d Eine Stahldüse mit ellipsoider Querschnittsform, gedruckte Gelma-Streben, verarbeitet über CB und OAB, und das Seitenverhältnis (Länge der langen Achse (L1)/Länge der kurzen Achse (L0) der gedruckten Strebe) ermittelt anhand der optischen Querschnittsbilder der gedruckten Streben. e Optische Bilder von drei Kunststoffdüsen mit unterschiedlichen Querschnittsformen (N-1: rund, N-2: plus, N-3: sternförmig) und gedruckte Gelma-Querschnittsformen, die mit jeder Kunststoffdüse und dem OAB-Verfahren hergestellt wurden. N-3-CB zeigt das optische Querschnittsbild von Gelma, das mit der Kunststoffdüsenform N-3 verarbeitet, aber über das CB-Verfahren und nicht über das OAB-Verfahren vernetzt wurde. f Optische Bilder, die verschiedene Gelma-3D-Strukturen unter Verwendung der N-3-Düse und des OAB-Verfahrens zeigen, und (g) optische und Fluoreszenzbilder (Kollagen: rot und Fibronektin: grün) der Oberfläche und der Querschnitts-Colma- und dECM-ma-Streben, die mit dem hergestellt wurden N-3-Kunststoffdüse und OAB-Verfahren. Alle Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die p-Werte wurden durch den Schüler-t-Test berechnet (n = 3/Gruppe; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001). Maßstabsbalken, 1 mm (A, C-Düse und Strebe); 200 µm (a, c – Strebenquerschnitt, e – SEM, g – Fluoreszenz und Querschnitt); 500 µm (c, e – Düsenquerschnitt, f – Querschnitt, g – optische Düsenbilder); 5 mm (f – Seitenansicht und Draufsicht).

Darüber hinaus wurden drei undurchsichtige Kunststoffdüsen mit unterschiedlichen Querschnittsformen [rund (N-1), plusförmig (N-2) und sternförmig (N-3)] verwendet, um den Gelma-Bioink mit dem OAB zu drucken Prozess, wie in Abb. 5e dargestellt. Die Querschnittsbilder der mit dem OAB-Verfahren gedruckten Gelma-Streben weisen Formen auf, die denen der Druckdüsen ähneln, wohingegen die mit der N-3-Düse und dem CB-Verfahren gedruckten Gelma-Streben (N-3-CB) keine Form aufweisen ähnlich dem der Druckdüse (Querschnitt sternförmig). Darüber hinaus zeigt die ergänzende Abbildung 6 optische Bilder einer gedruckten Gelma-Strebe mit N-2- und N-3-Düsen bei verschiedenen UV-Dosen (0–150 mJ/cm2). Um die mit dem OAB-Verfahren und der N-3-Düse hergestellten 3D-Gelma-Formen zu zeigen, haben wir die Formen mit drei verschiedenen Strukturen hergestellt, wie in Abb. 5f dargestellt.

Um die Durchführbarkeit des OAB-Prozesses auf verschiedene methacrylierte Hydrogele auszudehnen, wurden ein methacryliertes Kollagen (Colma) (Methacrylierungsgrad: 79,3 ± 1,6 %) und dECM-Methacrylat (dECM-ma, Methacrylierungsgrad: 76,0 ± 2,4 %) aus dem Skelett gewonnen Muskelgewebe wurde verwendet. Es wurde ein Schema der Dezellularisierungs-/Methacrylisierungsprozesse unter Verwendung von Schweinemuskelgewebe beschrieben (ergänzende Abbildung 7a) und DNA-Gehalte sowie Kollagen-, Elastin- und GAG-Gehalte für Muskelgewebe, Colma und dECM-ma wurden gezeigt (ergänzende Abbildung 7b – e). . Abbildung 5g zeigt die Oberflächen- und Querschnittsbilder und Fluoreszenzbilder (Kollagen: rot, Fibronektin: grün) der gedruckten Streben unter Verwendung der N-3-Düse und des OAB-Verfahrens. Das mikrorillige Oberflächenmuster war bei den Colma- und dECM-ma-Streben deutlich zu beobachten.

Durch Übernahme der folgenden Druckparameter: UV-Dosis = 120 mJ/cm2, Temperatur = 10 °C, Druckdruck = 120 ± 10 kPa, Düsenbewegungsgeschwindigkeit = 1 mm/s, zellbeladene Gelma-Filamente (5 Gew.-% Gelma, C2C12). Dichte von 1 × 107 Zellen/ml) wurden unter Verwendung der CB- und OAB-N-3-Prozesse (Düsenform: N-3) hergestellt. Wie in Abb. 6a dargestellt, zeigen die optischen Oberflächen- und Querschnittsbilder der zellbeladenen Gelma-Streben runde bzw. sternförmige Formen für die mit CB bzw. OAB-N-3 verarbeiteten Streben. Die lebenden (grün)/toten (rot) Bilder und die Zelllebensfähigkeit (CB = 92,5 ± 2,2 % und OAB-N-3 = 91,9 ± 1,8 %) der Streben am 1. und 3. Tag der Zellkultur zeigten, dass die Prozesse, einschließlich jedes Photovernetzungsverfahrens, waren für die beladenen Zellen sicher (Abb. 6b, c).

a Optische Oberflächen- und Querschnittsbilder der Gelma-Streben, verarbeitet im CB- und OAB-Verfahren mit der N-3-Düse. b Lebend (grün)/tot (rot) am 1. und 3. Kulturtag und (c) Lebensfähigkeit der Zellen für jede Gelma-Strebe. d Zellproliferation bestimmt mit dem MTT-Assay für die Gelma-Streben. e DAPI (blau)/Phalloidin (rot) nach 14 Tagen Kultur und (f) DAPI/MHC (grün) nach 21 Tagen Kultur (weiße Kästchen zeigen vergrößerte Region an). g MHC-Orientierungsfaktor, positiver Index und Fusionsindex für die C2C12-beladenen Gelma-Streben nach 21 Tagen Zellkultur. h Relative Genexpression von MHC und Troponin T in CB- und OAB-N-3-Strukturen am 14. und 21. Tag der Zellkultur. Alle Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die p-Werte wurden durch den Schüler-t-Test berechnet (n = 5/Gruppe; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001). Maßstabsbalken, 500 µm (a – Oberfläche, e, f – oberes Panel); 200 µm (a – Querschnitt, b); 100 µm (e, f – unteres Feld).

Darüber hinaus haben wir die Zellproliferation mithilfe des MTT-Assays für die Streben gemessen und festgestellt, dass sich die Proliferationsrate zwischen den Streben nicht wesentlich unterschied. Um die Zellmorphologie der Gelma-Streben zu beobachten, wurden DAPI- (blau)/Phalloidin- (rot) Bilder nach 14 Tagen Zellkultur aufgenommen. In den aufgezeichneten Bildern wurde uniaxial ausgerichtetes F-Actin in der Gelma-Strebe mit einem gerillten Oberflächenmuster beobachtet, die mit dem OAB-N-3-Verfahren hergestellt wurde, während in der mit dem CB-Verfahren gedruckten Strebe eine ähnliche uniaxiale Ausrichtung von F-Actin zu beobachten war nicht erreicht (Abb. 6e). Darüber hinaus zeigten DAPI/MHC-Bilder (grün) nach 21 Tagen Zellkultur gut ausgerichtete und beschleunigte MHCs, bestimmt durch den Orientierungsfaktor (=[90 − φ]/90, wobei φ = volle Breite bei halbem Maximum in einer Ausrichtungsverteilung ) und positivere Index-/Fusionsindexwerte wurden bei den mit OAB-N-3 verarbeiteten Gelma-Streben beobachtet als bei den mit CB verarbeiteten Streben (Abb. 6f, g).

Um die myogene Differenzierung der gedruckten Gelma-Streben zu beobachten, wurde die myogene Genexpression (MHC und Troponin T) am 14. und 21. Tag der Zellkultur beobachtet (Abb. 6h). Die myogenen Gene wurden in der mit OAB-N-3 verarbeiteten Gelma-Gruppe hochreguliert; Dies war auf den topografischen Hinweis (Rillenform) im Inneren der Düse zurückzuführen, der speziell für die Zellausrichtung entwickelt wurde. Diese Ergebnisse stimmen gut mit den Ergebnissen mehrerer Studien überein, die gezeigt haben, dass verschiedene Gerüste mit einachsigen topografischen Mustern die Ausrichtung von Myoblasten und sogar die Myotube-Bildung anpassen können33,34,35. Hierin wurden immortalisierte C2C12-Zellen verwendet, um die zellulären Aktivitäten in vitro zu bewerten. Allerdings können die In-vitro-Ergebnisse bei Verwendung primärer autologer oder allogener Zellen abweichen.

Die mit den Verfahren CB, OAB-N-1 (Düsenform: N-1) und OAB-N-3 (Düsenform: N-3) hergestellten hASC-beladenen Gelma-Streben wurden auf die erhaltene VML-Geweberegeneration angewendet durch Herausschneiden von 40 % eines ursprünglichen TA-Muskels in einem Mausmodell36. In dieser Analyse haben wir hASCs verwendet, um die Regeneration defekter VML37,38 zu unterstützen, da die Differenzierung von hASCs in mehrere Zelllinien, einschließlich einer myogenen Linie, durch verschiedene chemische und physikalische Reize induziert werden kann39. Wie in Abb. 7a dargestellt, wurden die hergestellten, mit hASCs beladenen Gelma-Konstrukte (Zelldichte = 1 × 107 Zellen/ml, Größe = 2 × 4 × 1,6 mm3) (CB, OAB-N-1 und OAB-N-3) wurden im defekten Muskelbereich appliziert. Wie erwartet waren die hASCs in allen drei Strukturen am Leben und die in der OAB-N-3-Gruppe beladenen Zellen waren im Vergleich zu denen in CB und OAB-N-1 in Druckrichtung gut ausgerichtet (Abb. 7a – c).

a Optische Bilder, lebend/tot am Tag 1 und 3, und DAPI/Phalloidin-Bilder am 7. und 14. Tag von CB- und OAB-Muskelkonstrukten (OAB-N-1 und OAB-N-3), beladen mit menschlichen Fettstammzellen, verarbeitet mit N-1- bzw. N-3-Düsen. b Zelllebensfähigkeit der Muskelkonstrukte am 1. und 3. Tag der Zellkultur (n = 5 pro Gruppe, vier Zufallsfelder in jeder Probe) und (c) Orientierungsfaktor unter Verwendung von F-Aktin am 14. Tag der Zellkultur (n = 5). pro Gruppe, vier Zufallsfelder in jeder Stichprobe). d Grobes Erscheinungsbild der im TA-Muskeldefekt implantierten Konstrukte. Quantifizierte (e) Griffstärke, (f) Latenzzeit bis zum Falltest und (g) Muskelgewicht nach 4-wöchiger Implantation (n = 5 pro Tier, drei wiederholte Messungen pro Probe). h H&E (lila: Kerne, rosa: Zytoplasma), MT (rot: Muskelfasern, blau: Kollagen) und DAPI/MHC (grün) der transplantierten Stellen, (i) fibrotischer Bereich (%) (n = 5 pro Gruppe, vier Zufallsfelder in jeder Probe), (j) zentral kernhaltige Myofaser (%) (n = 5 pro Gruppe, vier Zufallsfelder in jeder Probe), (k) peripher kernhaltige Myofaserfläche (%) (n = 5 pro Gruppe, vier Zufallsfelder in jeder Probe), (l) Durchmesser der Myofasern (μm) (n = 25 pro Gruppe, vier Zufallsfelder in jeder Probe) und (m) MHC-positive Fläche (%) (n = 5 pro Gruppe, vier). Zufallsfelder in jeder Stichprobe) für Schein-, Nur-Defekt-, CB-, OAB-N-1- und OAB-N-3-Proben. Alle Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die p-Werte wurden durch den Student-t-Test (b, c) und eine einfaktorielle ANOVA mit Tukeys Post-hoc-Test (e–m) berechnet (NS-Statistik-Nichtsignifikanz, *p < 0,05; **p < 0,01; *** p < 0,001). Maßstabsleiste, 2 mm (a – optisch, d); 500 µm (a – lebend/tot, h – H&E); 100 µm (a – DAPI/Phalloidin); 50 µm (h – H&E vergrößert, MT, DAPI/MHC).

Um die Effizienz der VML-Muskelregeneration zu beurteilen, wurden fünf Gruppen gebildet: (1) Schein (kein Defekt), (2) nur Defekt, (3) CB, (4) OAB-N-1 und (5) OAB-N-3 Gruppe wurden in das Mausmodell implantiert (Abb. 7d). Die Bewertung der Griffstärke und der Sturzlatenz ist eine zuverlässige Beurteilung der Wirksamkeit der Muskelregeneration14,40,41,42. Daher sind die Ergebnisse des Griffstärketests und des Sturzlatenztests bei Mäusen 4 Wochen nach der Implantation der Konstrukte in Abb. 7e–g dargestellt. Die OAB-N-3-Gruppe zeigte eine deutlich höhere Griffstärke als die anderen Gruppen und eine ähnliche Griffstärke wie die Scheinprobe (Abb. 7e). Die Sturzlatenzzeit zeigte jedoch im Vergleich zu den anderen Gruppen eine relativ längere Latenzzeit, war jedoch deutlich niedriger als die der Scheingruppe (Abb. 7f). Wir führen diese Befunde auf die Denervierung der Muskelfasern nach dem VML-Defekt zurück, die zu einer Funktionsbeeinträchtigung führt42,43,44. Um diesen Effekt zu beurteilen, wurden die entnommenen Muskelabschnitte mit Acetylcholinrezeptoren (AchR) angefärbt (ergänzende Abbildung 8a). Bei den Mäusen, die OAB-N-3 erhielten, wurden im Vergleich zu anderen Gruppen deutlich höhere AchR-Expressionen beobachtet (ergänzende Abbildung 8b). Darüber hinaus war das Muskelgewicht der OAB-N-3-Gruppe dem der Scheingruppe sehr ähnlich (Abb. 7g). Abbildung 7h zeigt die longitudinalen histologischen Ergebnisse von H&E, MT-Färbung und DAPI/MHC, und ergänzende Abbildung 9 zeigt die H&E-Färbung im Querschnitt. Die fibrotischen Bereiche, die zentral kernhaltige Myofaser, der peripher kernhaltige Myofaserbereich, der Durchmesser der Myofasern und der MHC-positive Bereich wurden gemessen und die Ergebnisse sind in Abb. 7i – m dargestellt. Wie aus den Ergebnissen hervorgeht, wurden in der OAB-N-3-Gruppe im Vergleich zu den entsprechenden Werten in den CB- und OAB-N-1-Gruppen eine effizientere Muskelregeneration und ein geringerer Grad an Fibrose (blauer Bereich in der MT-Färbung) festgestellt dass die topografischen Hinweise, verursacht durch die Nut der Düse, die im OAB-N-3-Prozess verwendet wird. Darüber hinaus waren die zentral kernhaltigen Muskelfasern in den Muskelabschnitten der Mäuse, die mit OAB-N-3 verarbeitet wurden, im Vergleich zu denen von Defekt, CB und OAB-N-142,45,46 erheblich geringer. Basierend auf diesen Ergebnissen sagen wir sorgfältig voraus, dass das OAB-N-3-Biokonstrukt ohne topografische Hinweise eine effektivere Muskelregeneration induzieren kann als das in den CB- und OAB-N-1-Gruppen.

Interessanter ist, dass die in den implantierten Konstrukten gebildeten Myofasern von den gedruckten hASCs im CB, OAB-N-1 bzw. OAB-N-3 stammten, wie durch doppelte Immunfluoreszenz für MHC/MRPL11 und MHC/HLA-A bestätigt wurde 4 Wochen nach der Implantation (Abb. 8a). Insbesondere lässt sich beobachten, dass die OAB-N-3-Gruppe deutlich höhere MRPL11- und HLA-A-positive Muskelfasern aufweist als andere Gruppen (CB und OAB-N-1) (Abb. 8b, c). Basierend auf den histologischen Ergebnissen können wir schließen, dass die Muskelregeneration unter Verwendung des zellbeladenen Gelma-Konstrukts, das mit dem OAB-N-3-Verfahren verarbeitet wurde, im Vergleich zu der Verwendung des Gelma-Konstrukts, das mit dem CB- und OAB-N-1-Verfahren verarbeitet wurde, beschleunigt werden kann. Trotz dieser positiven Ergebnisse zur Muskelregeneration im Hinblick auf das vorgeschlagene Konstrukt (OAB-N-3) ist jedoch darauf hinzuweisen, dass aufgrund der geringen Defektgrößen des Maus-VML-Modells die klinische Relevanz fehlt.

a Doppelte Immunfluoreszenzbilder von DAPI (blau)/MHC (rot)/MRPL 11 (grün) und DAPI (blau)/MHC (rot)/HLA-A (grün). Quantifiziert (b) MRPL11 und (c) HLA-A-positive Myofaser (%) (n = 5 pro Gruppe, vier Zufallsfelder in jeder Probe). Alle Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die p-Werte wurden durch eine einfaktorielle ANOVA mit Tukeys Post-hoc-Test berechnet (NS = statistische Nichtsignifikanz, *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001). Maßstabsbalken, 200 µm (a – DAPI/MHC/MRPL11); 50 µm (a – DAPI/MRPL11, DAPI/HLA-A); 100 µm (a – DAPI/MHC/HLA-A).

In dieser Studie haben wir ein neuartiges Bioprinting-Verfahren entwickelt, das durch eine durch optische Fasern unterstützte Photovernetzungsmethode ergänzt wird, um zellbeladene Filamente mit mikrostrukturierten Oberflächen für Tissue-Engineering-Anwendungen herzustellen. Um biofunktionale, zellbeladene Streben mit topografischem Hinweis zu erhalten, wurden geeignete Druckparameter wie UV-Dosis und Drucktemperatur sorgfältig ausgewählt. Um die Machbarkeit des Bioprinting-Prozesses zu demonstrieren, wurden C2C12-Myoblasten und hASCs verwendet, um in vitro myogene Aktivitäten bzw. volumetrische Muskeldefekte in vivo in einem Mausmodell zu beobachten. Aufgrund des biomimetischen Phänotyps der mit OAB-N-3 verarbeiteten zellbeladenen Gelma-Konstrukte wurde eine verbesserte In-vivo-VML-Reparatur im Vergleich zu Biokonstrukten beobachtet, die mit herkömmlichen Druckverfahren gedruckt wurden. Basierend auf diesen Ergebnissen glauben wir, dass das neu entwickelte Bioprinting-Verfahren in Kombination mit optischer Faser-unterstützter Vernetzung als vielversprechender Ansatz zur Herstellung biofunktionaler zellbeladener Konstrukte für die Anwendung bei verschiedenen Geweberegenerationen dienen kann.

Das fasergestützte Bioprinting-System bestand aus drei Hauptteilen: einem 3D-Drucker (DTR3-2210 T-SG; DASA Robot, Korea), einem Ultraviolett (UV)-Generator mit einem UV-Spot-Kopf (LGA-20562; Liim Tech, Korea) und einer Düse kombiniert mit einer optischen Faser, wie in Abb. 1a–c dargestellt. Quarzglasfasern (Durchmesser = 200 μm, Länge = 5,5 cm, numerische Apertur = 0,22, Edmund Optics, NJ, USA) mit geringer Dämpfung gegenüber UV-Strahlung (40 db/km) wurden von Edmund Optics (Barrington, NJ, USA) gekauft. . Kunststoffdüsen wurden mit einem digitalen lichtverarbeitenden 3D-Drucker (X-CUBE3, Foshan Stek Technology, China) mit fotohärtbarem Acrylatharz (3DV-301; WOW 3D, Südkorea) hergestellt. Nach dem Drucken wurden die Düsen mit Ethanol gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet. Anschließend wurde die Lichtleitfaser in die Kunststoffdüsen eingeführt.

Die Methacrylierung von Gelatine wurde wie zuvor berichtet durchgeführt47. Kurz gesagt, aus Schweinehaut gewonnene Gelatine (10 Gew.-%; 300 g Bloom; Sigma-Aldrich) wurde in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gelöst. Methacrylsäureanhydrid (Sigma-Aldrich, USA) wurde tropfenweise bei 50 °C zugegeben und die Lösung 3 Stunden lang bei 500 U/min gerührt. Gelma wurde in destilliertem Wasser unter Verwendung einer Dialysemembran mit einem Molekulargewicht von 12 kDa (Thermo-Fisher Scientific, USA) 7 Tage lang bei 40 ° C dialysiert, um das verbleibende Methacrylsäureanhydrid zu entfernen. Schließlich wurde Gelma lyophilisiert und in einem Tiefkühlschrank gelagert.

Die Gelma-Lösung (5 Gew.-%) wurde in PBS, das Lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat (0,05 Gew.-%; Sigma-Aldrich, USA) enthielt, bei 37 °C gelöst. Zur Sterilisation der Gelma-Hydrogele wurden 0,22 μm Spritzenfilter (Thermo-Fisher Scientific, USA) verwendet. Zwei verschiedene Gelma-Bioinks wurden durch Mischen mit C2C12-Mausmyoblasten (CRL-1772; ATCC, Manassas, VA, USA) und hASCs (PT-5006; Lonza, Basel, Schweiz) in einer Dichte von 1 × 107 Zellen/ml erhalten.

Zur Bewertung der rheologischen Eigenschaften der Gelma-Bioinks wurde ein Bohlin Gemini HR Nano-Rotationsrheometer (Malvern Instruments, UK) verwendet, das mit einer Acryl-Parallelplattengeometrie (Durchmesser = 40 mm und Spalt = 200 μm) ausgestattet war. Ein Zeitdurchlauftest (Dehnung = 1 %, Temperatur = 10 °C und Frequenz = 1 Hz) des Gelma-Bioinks wurde unter verschiedenen UV-Bedingungen durchgeführt. Ein Temperaturdurchlauftest (4–45 °C) der Gelma-Lösung wurde mit einer Anstiegsgeschwindigkeit (5 °C/min) bei einer festen Frequenz von 1 Hz und einer Dehnung von 1 % durchgeführt.

Zur Herstellung der zellbeladenen Konstrukte wurde eine Glasfaserdüse in Verbindung mit einem dreiachsigen Drucksystem (DTR3-2210 T-SG; DASA Robot, Korea) und einem Abgabesystem (AD-3000C; Ugin-tech, Korea) verwendet . Die Prozessparameter waren wie folgt: Düsenbewegungsgeschwindigkeit = 2 mm/s, Bioink-Durchflussrate = 0,045 ml/min, Zylindertemperatur = 10 °C und Wassermanteltemperatur = 4 °C. Während des Extrusionsprozesses wurde der Bioink zur Vernetzung gleichzeitig einer UV-Dosis [(Dosis = Iv × t; Iv = UV-Intensität (20 mW/cm2), t = UV-Belichtungszeit (6 s)] von 120 mJ/cm2 ausgesetzt Die UV-Intensität wurde mit einem UV-Lichtmessgerät (LS125; Linshang, China) gemessen.

Die morphologische Charakterisierung wurde unter Verwendung eines optischen Mikroskops (BX FM-32; Olympus, Tokio, Japan) durchgeführt, das mit einer Digitalkamera und einem Rasterelektronenmikroskop (SNE-3000M; SEC, Inc., Südkorea) ausgestattet war. Die ImageJ-Software (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) wurde verwendet, um Unterschiede zwischen den Grauwerten des Querschnitts, der Zirkularität (=4π × A/P2, wobei A = Fläche und P = Umfang) und dem ermittelten Seitenverhältnis zu erkennen durch die längste Länge/kürzeste Länge. Die biologische Abbaubarkeitsrate wurde durch 7-tägiges Eintauchen der Proben in PBS bei 37 °C ermittelt. Unterschiede in den Änderungen des Strebendurchmessers wurden berücksichtigt, um die Verschlechterungsrate zu messen.

Mechanische Analysen, einschließlich Zug- und Überlappungsschertests der Strukturen, wurden mit einer Universal-Zugmaschine (Toptech 2000; Chemilab, Korea) durchgeführt. Um die Zugeigenschaften zu messen, wurden die Proben (10 × 3 × 1,6 mm3) mit einer Geschwindigkeit von 0,5 mm/s unter Verwendung einer 30-kgf-Wägezelle getestet. Zur Berechnung der Haftungseigenschaften zwischen den gedruckten Konstrukten (10 mm × 25 × 1,6 mm3) basierte der Schertest auf ASTM F2255-0548 mit einer Dehngeschwindigkeit von 0,5 mm/s.

Für die In-vitro-Bewertung wurden zellbeladene Konstrukte (C2C12-Myoblasten oder hASCs) mit Zelldichten von 1 × 107 Zellen/ml und Abmessungen von 6 × 30 × 1,6 mm3 biogedruckt. Die mit C2C12 beladenen Konstrukte wurden in Gewebekulturplatten mit sechs Vertiefungen mit Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit hohem Glucosegehalt, das 1 % Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep, Thermo-Fisher Scientific, USA) und 10 % fötales Rinderserum enthielt, kultiviert ( FBS, Gemini Bio-Products, USA). Darüber hinaus verwendeten wir DMEM mit hohem Glucosegehalt, ergänzt mit 2 % Pferdeserum (Sigma-Aldrich St. Louis, USA), um die Myogenese zu induzieren. Die hASC-beladenen Konstrukte wurden in Gewebekulturplatten mit sechs Vertiefungen mit DMEM mit niedrigem Glucosegehalt, das 1 % Pen-Strep und 10 % FBS enthielt, kultiviert. Darüber hinaus verwendeten wir ein DMEM-Nahrungsergänzungsmittel mit niedrigem Glukosegehalt, das 5 % Pferdeserum, 0,1 μM Dexamethason und 50 μM Hydrocortison enthielt. Das Medium für alle Proben wurde alle 3 Tage gewechselt.

Die Lebensfähigkeit der Zellen innerhalb der zellbeladenen Konstrukte wurde mit einem Lebend-/Tot-Assay-Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers untersucht. Die zellbeladenen Konstrukte wurden nach einem Tag Kultur gesammelt, mit Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) gewaschen und in einer Reagenzlösung (0,15 mM/ml Calcein AM und 2 mM Ethidium Homodimer-1 in DPBS) bei Raumtemperatur inkubiert 40 Minuten für den Lebend-/Tot-Assay. Drei Bilder der gefärbten Proben wurden mit einem konfokalen Mikroskop (LSM 700; Carl Zeiss, Deutschland) nach vorsichtigem Waschen mit DPBS aufgenommen. Anhand dieser Bilder haben wir den Mittelwert der Zelllebensfähigkeit (%) als Verhältnis der lebenden Zellen zur Gesamtzahl der Zellen quantifiziert, indem wir die Anzahl der lebenden Zellen (grün) und toten Zellen (rot) mithilfe der ImageJ-Software gezählt haben.

Die zelluläre Stoffwechselaktivität innerhalb des Konstrukts wurde mit einem 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay-Kit (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) gemessen. Nach 1, 3 und 7 Tagen Kultur wurde die Aktivität der mitochondrialen Dehydrogenase in lebenden Zellen bei einer Absorption von 570 nm nach 4-stündiger Exposition gegenüber 0,5 mg/ml der MTT-Lösung bei 37 °C gemessen. Die von zellfreien Konstrukten erhaltenen Absorptionswerte wurden von denen der zellbeladenen Konstrukte abgezogen.

Die biogedruckten Konstrukte, die C2C12-Myoblasten und hASCs enthielten, wurden 30 Minuten lang in 3,7 % Paraformaldehyd (Sigma-Aldrich) fixiert, 1 Stunde lang mit einem serumfreien Proteinblocker (Agilent) blockiert und mit 0,1 % Triton X-100 permeabilisiert ( Sigma-Aldrich) für 3 Min. Das Zytoskelett der Zellen in den biogedruckten Konstrukten wurde durch Immunfluoreszenz unter Verwendung von Alexa Fluor 594-konjugiertem Phalloidin (rot; 1:100 in DPBS; Invitrogen) sichtbar gemacht, und die Kerne wurden mit Diamidino-2-phenylinodol (DAPI) (blau; 1:100) gefärbt in DPBS; Invitrogen). Der Orientierungsfaktor [=(90° − φ)/90°, φ = Halbwertsbreite (FWHM)] wurde mit der ImageJ-Software analysiert.

Für die Immunfluoreszenz der schweren Kette von Myosin (MHC) wurden die biogedruckten Konstrukte mit einem Anti-MF20-Primärantikörper (5 μg/ml; Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa City, IA, USA) behandelt und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurden die Proben mit DPBS gewaschen und mit Alexa Fluor 488-konjugierten Sekundärantikörpern (grün; 1:50 in DPBS; Invitrogen) 1 Stunde lang inkubiert. Abschließend wurden die Zellkerne mit DAPI angefärbt. MHC/DAPI-Immunfluoreszenzbilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop sichtbar gemacht und aufgenommen, und die Myofaserreife (MHC-positiver Index und Fusionsindex) wurde mit der ImageJ-Software quantifiziert.

Für die quantitative Analyse der Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) in Echtzeit wurden die biogedruckten Konstrukte nach 14 und 21 Tagen Kultur gesammelt und myogene Genmarker für MHC und Troponin T verwendet. Kurz gesagt, die zellbeladenen Konstrukte wurden mit einem TRIzol-Reagenz (Sigma-Aldrich) behandelt, um die RNA zu isolieren. Die RNA-Konzentration und -Reinheit wurden mit einem Spektrophotometer (FLX800T; BioTeK, USA) gemessen. Die RNA-Proben wurden vor der cDNA-Synthese mit RNase-freier DNase behandelt. cDNA-Proben wurden mit dem Power SYBRVR Green qPCR Master Mix (Qiagen) synthetisiert. Zur Durchführung der RT-PCR-Analyse wurde ein StepOnePlus-Echtzeit-PCR-System (Applied Biosystems, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers verwendet. Zur Normalisierung wurde das Housekeeping-Gen Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) verwendet. Die spezifischen Primersequenzen für die Zielgene sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Bei C57BL/6-Mäusen (männlich, 10 Wochen alt, DooYeol Biotech, Inc., Seoul, Korea) wurden TA-Muskeldefekte erzeugt, und alle Tierversuche wurden gemäß dem vom Institutional Animal Care and Research Advisory Committee genehmigten Protokoll durchgeführt Das Labortierforschungszentrum der Sungkyunkwan University School of Medicine hat die Vorschriften des Institutionellen Ethikausschusses eingehalten (SKKUIACUC2021-08-11-2). Kurz gesagt, die Mäuse wurden zufällig in fünf Gruppen eingeteilt (insgesamt 25 Mäuse, n = 5 pro Gruppe). Vor der Implantation wurden die Mäuse zunächst mit 3 % v/v Isofluran anästhesiert und ihre Muskeln wurden durch Einschneiden der Haut unter dem linken und rechten Bein von der Faszie isoliert. Anschließend wurden der Extensor Digitorum Longus und der Extensor Hallucis Longus entfernt, um eine Verletzung durch volumetrischen Muskelverlust (VML) auszulösen, und etwa 40 % der TA-Muskeln wurden herausgeschnitten und gewogen (Ergänzungstabelle 1). Zur VML-Restaurierung wurden hASC-beladene biogedruckte Konstrukte (2 × 4 × 1,6 mm3) in TA-Muskeldefektregionen transplantiert und mit genähter Faszie und Haut abgedeckt. Nach der Implantation erhielten die Mäuse eine subkutane Injektion von 0,5 mg/kg Buprenorphin zur Schmerzlinderung und erhielten nach der Operation wie gewohnt Futter und Wasser. Nach 4 Wochen Implantation wurden die Mäuse durch CO2-Inhalation und sekundäre Zervixluxation eingeschläfert. Vor der Transplantation wurden die hASC-beladenen Konstrukte einen Tag lang in einem Wachstumsmedium kultiviert, um die Zellen zu stabilisieren31,49.

Die Skelettmuskelfunktionalität von Mäusen, die verschiedene Behandlungen erhielten, wurde durch Messung der Griffstärke und der Latenzzeit beim Fallen beurteilt. Die maximale Griffstärke der Mäuse 4 Wochen nach der Transplantation wurde gemessen, indem die Maus parallel zur Gitterlinie gezogen und die Griffstärke (Griffstärkemessgerät, BIO-G53, BIOSEB, FL, USA) gemäß dem beschriebenen Verfahren gemessen wurde50. Zusätzlich wurde die Latenzzeit bis zum Fallen bewertet, indem die Zeit gemessen wurde, die verging, nachdem die Maus auf eine Stange gesetzt wurde. Die maximale Latenzzeit wurde auf 300 s festgelegt. Jedes Experiment wurde dreimal pro Maus wiederholt. Zwischen den Wiederholungen wurde eine Intervalldauer von 5 min vorgesehen (n = 5 pro Tier, drei Wiederholungsmessungen pro Probe).

Zur histologischen Färbung wurden die entnommenen TA-Muskelproben 24 Stunden lang mit 10 % neutral gepuffertem Formalin fixiert. Anschließend wurden die Proben dehydriert, in Paraffin eingebettet und in fünf Mikrometer dicke Scheiben geschnitten. Die Muskelabschnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) und Masson-Trichrom (MT) gefärbt. Die H&E-gefärbten Bilder und MT-gefärbten Bilder wurden mit der ImageJ-Software analysiert, um die zentral kernhaltigen Myofasern, den peripher kernhaltigen Myofaserbereich bzw. den fibrotischen Bereich zu quantifizieren (n = 5 pro Probe, vier Zufallsfelder in jeder Probe). Die zentral kernhaltigen Myofasern und peripher kernhaltigen Muskelfasern werden manuell mit dem Multipoint-Tool in imageJ gezählt. Die zentral kernhaltigen Muskelfasern wurden erhalten, indem die Anzahl der zentral kernhaltigen Muskelfasern durch die Gesamtzahl der Muskelfasern dividiert wurde. Darüber hinaus wurde die peripher kernhaltige Myofaserfläche berechnet, indem die Fläche der peripher kernhaltigen Myofasern durch die Fläche der gesamten Muskelfasern dividiert wurde.

Zur Immunfluoreszenzfärbung wurden die geschnittenen Proben mit einem Anti-MF20-Primärantikörper (5 μg/ml; Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa City, IA), Anti-MRPL11 (polyklonales antimitochondriales ribosomales Kaninchenprotein L11, Speziesreaktivität: Mensch, 1) behandelt :100-Verdünnung; Abcam, Cambridge, UK), Anti-HLA-A (Artenreaktivität: Mensch, 1:100-Verdünnung; Abcam, Cambridge, UK), Anti-CHRNB2 (neuronale Acetylcholinrezeptor-Untereinheit Beta-2, 1:100-Verdünnung). , Thermo-Fisher Scientific, USA) und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurden die Proben mit DPBS gewaschen und mit Alexa Fluor 488-konjugierten Sekundärantikörpern (grün; 1:50 in DPBS; Invitrogen) oder Alexa 594-konjugierten Sekundärantikörpern (rot; 1:50 in DPBS; Invitrogen) und Alexa 488-konjugierten Sekundärantikörpern inkubiert. konjugiertes Anti-Kaninchen-IgG (1:200-Verdünnung, Invitrogen) für 1 Stunde. Abschließend wurden die Zellkerne mit DAPI angefärbt. MHC/DAPI-Immunfluoreszenzbilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen. Die Fläche der Muskelfasern pro Feld (%) (n = 5 pro Probe, vier Zufallsfelder in jeder Probe), der Durchmesser der Myofasern (n = 25 pro Probe, vier Zufallsfelder in jeder Probe) und die MHC-positive Fläche (%). ) (n = 5 pro Probe, vier Zufallsfelder in jeder Probe) wurden mit Immunfluoreszenzbildern für MHC/DAPI (400-fache Vergrößerung) blind gemessen. Die Fläche der MRPL11- und HLA-A-positiven Myofasern (%) wurde mit Doppelimmunfluoreszenzbildern für MHC/MRPL11 und MHC/HLA-A (400-fache Vergrößerung) blind gemessen (n = 5 pro Probe, jeweils vier Zufallsfelder). Probe). Alle Beispielbilder wurden mit der ImageJ-Software quantifiziert. Alle Werte werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt.

Zur Durchführung der statistischen Analysen wurde die Software SPSS (SPSS, Inc., USA) verwendet. Vergleiche von zwei Gruppen wurden durch einen T-Test ausgewertet, und drei oder mehr Gruppen wurden durch die Bewertung einer ein- oder zweiseitigen Varianzanalyse (ANOVA) mit dem HSD-Post-hoc-Test von Tukey verglichen. Werte von *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Studie wurde durch den Zuschuss der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, der vom Ministerium für Wissenschaft und IKT für bioinspirierte Innovationstechnologieentwicklungsprojekte (NRF-2018M3C1B7021997 und NRF-2021R1A5A8029876 an DR) und das Grundlagenforschungsprogramm (NRF-2021R1I1A1A01061021) finanziert wurde. . Diese Studie wurde auch durch einen Zuschuss des Ministeriums für Handel, Industrie und Energie (MOTIE, Korea) im Rahmen des Industrial Technology Innovation Program (20009652: Technologie zur Kommerzialisierung und Materialien von bioabsorbierbarem Hydroxyapatit mit einer Größe von weniger als einem Mikrometer) unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: JaeYoon Lee, Hyeongjin Lee.

Abteilung für Präzisionsmedizin, Medizinische Fakultät der Sungkyunkwan-Universität, Suwon, Republik Korea

JaeYoon Lee, Hyeongjin Lee und Geun Hyung Kim

Abteilung für Biotechnologie und Bioinformatik, Korea University, Sejong, Republik Korea

Hyeongjin Lee

Abteilung für Molekulare Zellbiologie, Medizinische Fakultät der Sungkyunkwan-Universität, Suwon, Republik Korea

Eun-Ju Jin & Dongrieol Ryu

Abteilung für Biomedizinische Wissenschaft und Technik, Gwangju-Institut für Wissenschaft und Technologie, Gwangju, Republik Korea

Dongryeol Ryu

Abteilung für Biophysik, Institut für Quantenbiophysik, Sungkyunkwan-Universität, Suwon, Republik Korea

Geun Hyung Kim

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JYLee: Konzeptualisierung, Datenanalyse, Methodik, Untersuchung, Visualisierung. H.Lee: Datenanalyse, Methodik, Untersuchung, Visualisierung, Schreiben – Originalentwurf. EJJ: Datenanalyse, Untersuchung. DR: Betreuung, Datenanalyse, Schreiben – Originalentwurf, Finanzierungsakquise. GHK: Aufsicht, Projektverwaltung, Konzeptualisierung, Datenanalyse, Schreiben – Originalentwurf, Überprüfung und Bearbeitung, Finanzierungseinwerbung.

Korrespondenz mit Dongryeol Ryu oder Geun Hyung Kim.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Lee, J., Lee, H., Jin, EJ. et al. 3D-Bioprinting mit einer neuen Photovernetzungsmethode zur Wiederherstellung von Muskelgewebe. npj Regen Med 8, 18 (2023). https://doi.org/10.1038/s41536-023-00292-5

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Eingegangen: 02. Juli 2022

Angenommen: 17. März 2023

Veröffentlicht: 31. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41536-023-00292-5

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